海人酸在大鼠海马腹后致癫痫的实验研究

海人酸在大鼠海马腹后致癫痫的实验研究

癫痫是神经系统的一种常见慢性疾病，约1.4是药物难治性癫痫，其中70%是肥叶癫痫。TLE临床研究较困难,建立具有TLE特点的动物模型是有效途径。海人酸(KA)结构类似谷氨酸,与突触后膜的受体结合,产生兴奋性突触后电流,致动物癫痫发作,即海人酸癫痫模型。材料和方法1.试剂和机器KA,Sigma公司,实验量0.8μg/0.2μl;立体定向仪;微量注射器1μl;Nicolet公司动态脑电图(EEG)仪。2.分组及研究方法雄性Wistar大鼠,280~320g,中国军事科学院环境研究所提供。随机分组,每组6只:(1)阴性对照组(N):观察5个月后取脑;(2)急性期组(A):7d;(3)静止期组:S1,14d;S2,28d;(4)慢性期组(C):5~6个月。3.立体定向注射组大鼠以10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔麻醉,于立体定向架上,手术暴露颅骨,立体定向引导于右侧海马腹后部(A5.6mm,L4.5mm,V7.0mm)20min匀速注射KA。4.症状监测每天1∶00PM~6∶00PM,每组2~3只大鼠行视频录像监测。5.电极置/南/双侧杏仁核每组抽取2只行深部EEG检测。立体定向置深部电极:双侧海马腹后部(A5.6mm,L4.5mm,V6.0mm),双侧杏仁核(A1.4mm,L5.0mm,V8.5mm);地/参考电极置于额骨。检测1~3次/周,2~4h/次。6.染色时间5.2%对苯二酚染色Nissl染色:光镜计数双侧CA1、CA3区和DG细胞。Timm’s染色:0.2%Na2S处理的标本于固定液(4%多聚甲醛+30%蔗糖)中过夜,冰冻切片30μm。暗室内染色60~90min,26℃水浴。显影液:30%阿拉伯树胶180ml+柠檬酸缓冲液30ml(柠檬酸7.65g和柠檬酸钠7.05g)+5.67%对苯二酚90ml+15%硝酸银1.5ml。蒸馏水冲洗,苏木素复染细胞核。7.统计方法SPSS10.0统计软件包,实验侧与对照侧数据行成对t检验,各组间数据行方差分析。结果1.eeg的癫痫模型实验动物根据症状分急性期(注射KA后约4~7d)、静止期(急性期后10d~2月)、慢性期(大鼠出现自发性癫痫发作以后)。急性期:出现上肢抖动、向左侧翻滚转圈、肢体强直等癫痫表现,持续3~5h。EEG局限于实验侧海马的丛集放电,扩展至边缘系统的其他结构,其间有发作后抑制。静止期:症状消失,EEG趋于正常,偶有慢波和尖棘波。慢性期:出现反复自发性癫痫发作,类似杏仁核点燃发作,持续40~60s,双侧前肢痉挛、全身抽搐站立和/或摔倒。EEG在海马和杏仁核出现发作性棘波活动,双侧均可见。2.海马ca1和ca2急性期:明显神经元变性、死亡,细胞结构瓦解。实验侧海马CA3区最早最明显,对照侧轻,两侧差异有显著性(P<0.05);CA1和CA2病变轻,两侧差异无显著性(P>0.05);齿状回(DG)无显著神经元缺失。DG无明显苔藓状纤维(MF)发芽。静止期:实验侧海马CA3、CA4区神经元缺失,达90%以上;胶质细胞增生。DG的浅颗粒层和内分子层开始出现MF发芽,并逐渐增加。慢性期:神经元缺失,胶质增生,海马萎缩。齿状回MF发芽进行性增加。海马CA3区锥体细胞变化见表1。讨论1.症状和eeg表现为本模型明显地分为急性期、静止期和慢性期,有如人类TLE病程的缩略版。2.近隔损害的模型神经元死亡:海人酸受体为离子型谷氨酸受体,在海马CA3区特异性高亲和力受体最多,因此CA3区最容易出现神经元过度兴奋而致神经元死亡。局部损害:在注射局部,KA与受体结合产生强烈的除极,当能量耗竭细胞内环境紊乱,细胞即死亡。远隔损害:(1)非选择性抽搐相关损害:主要在CAl区,与KA注射部位无确定的突触联系。损伤可以被抗痉挛剂阻断,与脑组织的血流/氧耗比下降所引起的缺血-缺氧有关。(2)选择性抽搐相关损害:主要在CA3区,与癫痫放电的突触传播有关。损害与抽搐的时程和间隔有关,KA模型急性期癫痫持续状态致明显神经元死亡,而点燃模型无明显神经元缺失。可能的死亡机制有:(1)钙超载学说。(2)锌毒性:MF在脑内锌含量最丰富,其去极化使Zn2+水平升高100倍以上,降低Zn2+水平可减少刺激MF所引起的CA3区放电。3.mf异常发芽与自身胞体或树突形成突变体的自反馈MF发芽形成的神经回路可使颗粒细胞的兴奋性增高,与癫痫放电的产生和传播有密切关系。MF以CA3区锥体细胞为靶点,CA3区锥体细胞死亡使MF失去靶点,从而MF异常发芽与自身胞体或树突形成突触,形成自身反馈的兴奋性突触;另外内分子层的传入纤维起始于门区神经元,门区神经元死亡,使MF发芽构成新的传入通路,形成异常自反馈。点燃模型中,反复的阈下刺激诱发癫痫及MF发芽,可见长期兴奋性冲动可使兴奋性通路强化、重塑突触联系。4.兴坚性氨基酸受体兴奋性机制增高:(1)神经递质:癫痫发作期,大鼠脑内兴奋性氨基酸水平增高,而KA致痫大鼠海马的谷氨酸转运有代偿性的增加。因此,轴突末稍谷氨酸释放增加可能是谷氨酸堆积的主要原因。(2)受体:兴奋性氨基酸受体上调是兴奋性增高的另一重要原因。KA模型大鼠海马各区N-乙酰-D-天门冬氨酸受体亚基1的mRNA水平长期增高(21d~4个月);代谢型谷氨酸受体mGluR1的mRNA和蛋白水平也有增高;拮抗兴奋性氨基酸受体的药物有抗癫痫作用。(3)神经网络重塑:本实验MF发芽与自发性癫痫发作密切相关,MF发芽出现得早、明显的动物,自发性癫痫症状较早出现。MF发芽亦见于TLE患者和多种慢性颞叶癫痫模型。另外,神经网络重塑还见于海马CA1区、内鼻皮质与DG间和海马与杏仁核间的联系通路。5.海马和杏仁核模型模拟γ-氨基丁酸(GABA)是脑主要的抑制性递质。抑制谷氨酸脱羧酶(GAD,GABA的合成酶)影响