骨髓源性干细胞移植对慢性马兜铃酸肾病大鼠肾小管功能损害的干预作用

骨髓源性干细胞移植对慢性马兜铃酸肾病大鼠肾小管功能损害的干预作用

马鞭酸病（aan）是由服用马鞭酸和其他中药引起的快速进展性车辆管理疾病。临床表现为慢性肾功能衰竭、进展性中重度贫血、小分子混凝土流失和肾衰竭。目前发病机制不清,亦无确切有效治疗办法。由于近年来的研究发现干细胞具有可塑性,干细胞疗法为现代肾脏疾病的研究提供了一个新的治疗途径。为观察干细胞是否能改善马兜铃酸肾病肾小管损害,本实验通过建立慢性AAN动物模型,观察了干细胞对慢性AAN大鼠尿酶和尿β2-MG排泄的干预作用。1材料和方法1.1关木通水部分中的水饼血清(尿)N-已酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性测定试剂盒;关木通:购自辽宁省中医研究院,产地东北,经辽宁中医研究院梁英研究员鉴定。关木通水煎剂:取关木通生药1000g,加5000ml水浸泡30min后加热至沸腾后煎煮1h,倒出药液,残渣再加入5000ml水继续煎煮1h,然后将两次药液合并,经过滤、浓缩后制成500ml水煎剂(相当于2g生药/ml),4℃冰箱保存备用。Wistar大鼠雌性30只,雄性10只,清洁级,周龄6-8W,体重190-210g。由中国医科大学动物部提供。1.2骨髓细胞的提取雄性正常Wistar大鼠,处死后置于75%酒精中浸泡10min,将供体鼠置于超净台内,消毒局部皮肤,常规铺巾,无菌切取股骨和胫骨,剥净肌肉组织,用PBS液洗涤2遍,剪去骨两端,再洗涤2遍,用注射器吸取5ml无血清RPMI-1640液反复冲洗骨髓腔,制成骨髓细胞悬液。收集并混合10只供体大鼠的骨髓细胞,过200目钢筛过滤制成单细胞悬液,TrisNH4Cl溶解红细胞,15ml离心管离心洗涤2次(1000-1500r/min离心5min),收集沉淀的骨髓细胞,调整细胞浓度为3.0×108/ml。台盼蓝染色计数活细胞率≥95%,常温备用。1.3阿莫西林公园感染大鼠骨髓干扰案n大鼠CAAN模型制备:予以20只雌性Wistar大鼠关木通水煎剂灌胃(20g·kg-1·d-1,相当于10ml·kg-1·d-1),分两次给予。每周连续用药5d,共12W。分组:(1)治疗组:取10只第12周已成模的CAAN大鼠,每只大鼠经尾静脉输入骨髓干细胞1×108个(0.35ml);移植前10d起饮水中加入阿莫西林(0.1%)预防感染。移植前3d起予以X线全身照射每日2次,2Gy/次,间隔4h,持续3d,源皮距100cm,照射时把受体大鼠放入经消毒的按大鼠尺寸定做的有机玻璃盒中。移植后大鼠置相对无菌环境喂养,每周以500mg/L有效氯消毒1次鼠笼,木屑垫料及饲料经高压消毒。(2)非治疗组:另取10只第12周已成模的CAAN大鼠,每只大鼠予以静脉输入等量生理盐水(NS)0.35ml。(3)正常对照组:取正常雌性Wistar大鼠10只,每只大鼠予以等量饮用水(10ml·kg-1·d-1,分两次给予,每周连续5d)灌胃12W后,经尾静脉静脉输入NS0.35ml。1.4尿nag活性测定分别于尾静脉输入骨髓干细胞或NS后第30天膀胱穿刺留取尿标本。用放射免疫法测β2-MG;用酶-底物直接显色法测定尿NAG活性。统计学分析采用SPSS12.0统计软件分析处理,计量数据表示,组间差异采用单因素方差分析。2结果2.1治疗大鼠一般情况及尿量变化关木通水煎剂灌胃第8周起,CAAN大鼠开始出现活动减少、进食差;干细胞治疗组:可见大鼠一般状态明显好转,活动增多、进食增加;非治疗组:大鼠一般状态继续恶化,活动明显减少、进食极少、毛色秽暗;正常对照组:进食及活动正常、毛色光泽、排成形便。体重变化:正常组大鼠体重稳定性增加;非治疗组大鼠体重增长缓慢,后期出现负增长;干细胞移植治疗组大鼠体重较非移植组明显增加。尿量变化:与正常组比较,非治疗组大鼠尿量明显增多(P<0.01)。治疗组尿量较非治疗组明显减少,较正常组增高,但均无统计学意义(P>0.05)。2.2两组显减少组对比尿β2-MG:与正常组比较,非治疗组明显增高(P<0.05);治疗组较非治疗组明显减少,存在显著性差异(P<0.05),但仍高于正常组(P<0.05)。尿NAG:正常肾脏有一定量分泌。与正常组比较,非治疗组明显增多(P<0.05);治疗组较非治疗组明显减少,存在显著性差异(P<0.05),但仍高于正常组(P<0.05)。3骨髓干细胞移植慢性AAN多由于长期小剂量服用含马兜铃酸的药物或由急性AAN进展而来,肾功能于停药后继续恶化,主要表现为慢性进展性的肾衰竭,目前发病机制尚不十分清楚,可能与AA致上皮细胞转分化为肌成纤维细胞,AA致肾小管上皮细胞坏死或凋亡,AA及其DNA加合物触发肾间质纤维化,引起肾微小血管缺血损伤等有关。目前对AAN的治疗尚缺乏有效方法。近年来研究发现成人骨髓干细胞可以分化为别的多种组织成熟细胞,例如:肝、肾、肺、皮肤、胃肠道的上皮细胞,心脏和骨骼肌的肌细胞,具有可朔性,这已被体内和体外的试验所证实。有研究表明在肾脏,移植的干细胞可以分化成近似肾小球、系膜细胞、小管细胞,干细胞移植入肾病变和损伤区域可以呈现出供者的表现型。干细胞是一种未分化细胞,是人体的起源细胞,具有自我复制和多向分化潜能,可参与组织的更新和修复,近几年研究发现其在一定条件下可以跨系统分化,这种跨系统分化的现象被称为干细胞的“可塑性”(plasticity)。基于对其可塑性的认识,经过大量研究,已在治疗白血病、糖尿病、心肌梗死、恶性肿瘤及先天性免疫缺陷病方面取得了明确疗效。研究表明干细胞在肾脏损伤修复过程中可起到一定的功能性修复作用,如明显降低血尿素氮(BUN)、减轻尿蛋白等。SujataKale及Morig[i7]等分别给急性肾衰和缺血再灌注小鼠进行骨髓干细胞移植,发现可以明显降低血尿素氮,促进肾小管损伤的恢复。HikaruSugimoto等将野生型小鼠的骨髓移植给8周龄COL4A3-/-(敲除3链的Ⅳ型胶原基因型)小鼠,检测发现骨髓来源祖细胞在受损肾小球中形成足细胞及系膜细胞,肾小球结构得到改善,蛋白尿减少。我们既往的研究发现CAAN大鼠肾组织存在肾间质纤维化、同时也存在骨髓损害,骨髓及肾组织CD34阳性细胞表达均下降,从而推测CAAN的发病可能与骨髓干细胞缺乏或受损相关。因此我们试用干细胞移植方法探讨干细胞对CAAN大鼠肾小管损害的改善情况。结果经骨髓干细胞移植治疗后Wistar大鼠肾小管功能得到明显改善:检测结果显示:治疗组β2-MG较非治疗组明显降低,与非治疗组比较P<0.05差异有统计学意义,说明干细胞移植可以明显改善CAAN大鼠的肾小管重吸收功能从而减轻小分子量蛋白如β2-MG的丢失;尿NAG酶检测结果显示:非治疗组尿NAG增高,与正常对照组比较有统计学意义P<0.05,治疗组较非治疗组明显降低P<0.05,差异有统计学意义,但仍高于正常对照组P<0.05。β2-MG、NAG是广泛应用于临床的、经典的肾小管损伤标记物,既能反映肾小管的功能变化,又能随时检测,是形态学诊断的重要补充,正常情况下,肾小管上皮细胞以胞吐形式向尿液中分泌少量NAG酶,尿液中含量极微,当肾小管细胞受损时,NAG酶大量从肾小管上皮细胞释放,使尿液中的NAG酶显著增加。结果证明CAAN大鼠存在肾小管功能损害,而干细胞移植后β2-MG、NAG下降说明干细胞可以减轻肾小管损害程度。动物试验已经表明干细胞对难治性肾脏疾病的治疗是一种新的可行的有效办法。David等用SLE动物模型进行骨髓移植,发现白细胞及血小板计数恢复正常,肾功能改善,肾组织病理学改变明显好转,抗DNA抗体和抗血小板抗体水平下降,生存期明显延长。本研究通过建立大鼠慢性AAN动物模型,观察到随着喂饲时间延长,正常组大鼠体重每周稳定性增长,而马兜铃酸造模各组体重增长缓慢,一般状态随病程延长越来越差,治疗组大鼠体重明显较非治疗组增加、一般状态明显好转