美多芭与安坦摄入后帕金森病大鼠行为学及大脑5-羟色胺表达的改变

美多芭与安坦摄入后帕金森病大鼠行为学及大脑5-羟色胺表达的改变

帕金森病（parkinson’sdisease，pd）是老年人的进展性中枢神经系统退行性疾病，主要以运动症状为特征，但近年来，抑郁、焦虑和智力低下等非运动症状逐渐引起人们的注意。PD患者伴发抑郁(depressioninPD,dPD)是PD患者最主要的精神症状并发症之一,Reijnders等总结了2007年之前(包括2007年)有关dPD研究的文献,认为平均35%的PD患者伴有临床表现明显的抑郁症状。dPD严重影响患者与家人的生活质量,因此,认识并且治疗PD患者的抑郁症状对降低PD患者的残疾与改善预后具有重要意义。dPD的发病机制复杂,包括社会心理学、病理、生理、治疗因素等多方面原因,目前抗PD治疗对情绪的影响日益受到重视。本研究选取PD治疗最常用的药物美多芭(Madopar)与安坦(Artane)进行研究,探讨dPD可能的发生原因及抗PD药物治疗对情绪的影响与作用途径。1材料和方法1.1抗鼠5-ht多克隆抗体清洁级成年健康雄性Wistar大鼠120只,体质量260～280g,由山东大学动物实验中心提供;6-羟基多巴胺(6-hyaroxyaopamine,6-OHDA)与阿朴吗啡(apomorphine,APO)(Sigma公司,美国);兔抗鼠5-HT多克隆抗体(Abcam公司,美国);抗兔/鼠通用型免疫组织化学检测试剂盒与DAB显色剂(武汉博士德生物工程有限公司);微量注射器(上海安亭微量进样器厂);自动脱水机、包埋机和病理切片机(LEICA公司,德国);OLYMPUS光学显微镜和OLYMPUS照相显微镜(SONY公司,日本)。1.2方法1.2.1实验组从120只大鼠中随机取30只,再随机分为空白对照组与假手术组,各15只,给予自由饮水进食。1.2.2诱导大鼠旋转剩余的90只大鼠称重,麻醉后固定于立体定向仪,参照大鼠脑立体定向图谱,使用微量注射器将6-OHDA8μL(溶于生理盐水,2μg/μL)注入右侧纹状体。2周后,APO0.5mg/kg诱导大鼠向健侧旋转,每周1次连续4周,每次旋转均向左侧,每分钟大于7圈,则PD动物模型建立成功。假手术组注射等量生理盐水代替6-OHDA,其余步骤同模型制作。APO诱导后,始终不旋转。实验造模成功大鼠55只,随机取45只,分为PD组、美多芭组与安坦组各15只。每日美多芭及安坦组胃内分别灌注美多芭(使左旋多巴L-dopa含量为12mg/kg)与安坦(0.45mg/kg)连续3个月。其他组大鼠每日灌注等量生理盐水。1.2.3行为测试1.2.3.1行为观察与体重测量停药24h后,观察喂养3个月各组大鼠的日常行为表现,并分别测量各组大鼠的体质量,求平均值以x¯±sx¯±s表示。1.2.3.蔗糖水与蔗糖水处理1%蔗糖水偏好度测定:实验前,先训练各组大鼠适应饮含糖水,第1个24h每笼放两瓶1%的蔗糖水,第2个24h,分别放1瓶1%的蔗糖水与1瓶自来水,在禁食禁水12h后,进行糖水实验。每笼分别放1瓶1%的蔗糖水与1瓶自来水,12h后交换两瓶水的位置,分别观察记录大鼠24h饮用自来水与1%的蔗糖水量,排除大鼠可能饮水习惯的影响。计算大鼠糖水偏爱度(蔗糖水消耗量/总液体消耗量×100%),并求平均值以x¯±sx¯±s表示。1.2.4组织碎片的制备心脏灌注、断头取脑,将大脑额叶与海马区脑组织放入4%多聚甲醛中,石蜡包埋,切成5μm切片。1.2.5不同的人工林和生物素质石蜡切片取出后置温箱65℃30min;脱蜡;梯度酒精水化;枸橼酸盐缓冲液抗原修复:将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中,微波炉内加热使缓冲液温度保持在92～98℃之间持续10～15min,注意不要沸腾。冷却后,PBS冲洗5min,3次;3%H2O2并37℃孵育10min阻断内源性过氧化物酶活性,PBS冲洗5min,3次;5%BSA封闭液,37℃孵育20min,甩去多余的液体,勿洗;加入兔抗鼠5-HT抗体(1∶500);加入生物素化二抗,完全覆盖组织,湿盒37℃孵育20min,PBS冲洗5min,3次;DAB显色,室温避光显色,显微镜下观察切片,反应时间一般在5～10min之间。蒸馏水洗涤。自来水充分冲洗;苏木素复染;1%盐酸酒精分色10s,自来水充分冲洗;返蓝、梯度酒精脱水、透明、封片。空白对照用0.01mmol/LPBS代替一抗,结果为阴性,以已知阳性切片作为阳性对照。1.2.65-ht染色观察据低倍镜观察,找到海马及额叶神经细胞分布的部位,每例随机选择5个高倍镜视野,计数阳性的神经细胞,计算平均值。1.3检验基准检验使用SPSS17.0统计软件对数据进行分析。以α=0.05作为检验水准。计量资料的数据以x¯±sx¯±s表示,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1理想国里环境因素空白对照组与假手术组表现较各组PD大鼠行为活跃,在有人靠近与喂食及喂水时,较多在笼内出现绕笼子转圈奔跑、直立、抬头张望等行为,而每组PD大鼠的这些活动明显减少,对外界条件改变反应迟钝。2.2平均体质量测定见表1。PD组、美多芭组、安坦组大鼠平均体质量明显低于空白对照组与假手术组(P<0.05),美多芭组与安坦组平均体质量低于PD组,但差异无统计学意义;PD组、美多芭组、安坦组大鼠糖水偏爱度明显低于空白对照组与假手术组(P<0.05),美多芭组与安坦组糖水偏爱度明显低于PD组,差异有统计学意义(P<0.05);安坦组糖水偏爱度低于美多芭组,但差异无统计学意义。2.3大叶和马尾辫组5-ht免疫组化染色阳性细胞的计数2.3.15-ht免疫组化结果显微镜下可见在5-HT免疫反应阳性的神经元细胞质内,表达位于胞浆,呈棕黄色,分布均匀,细胞核被苏木素复染成蓝色。2.3.2美多美对5-ht的影响在额叶与海马,美多芭组5-HT免疫反应明显弱于其他组。阳性神经细胞数显著减少(P<0.05,表2),着色变浅(图1、图2)。2.3.3报道中的5-htPD组与安坦组5-HT免疫反应弱于假手术组与空白对照组,但差异无统计学意义。PD组与安坦组相比,免疫反应无明显差异(表2)。3不同的、心理状态的大鼠抑郁行为L-dopa是PD诊断与药物治疗的金标准。大多数患者在其病程中都会接受L-dopa制剂的治疗,但随着病情的进展与用药时间的延长,其效果会逐渐减退,并出现一系列的运动并发症。近年来,L-dopa制剂治疗相关的非运动并发症,如神经精神症状已逐渐引起人们的注意。美多芭可以显著改善PD的运动症状,但本研究发现,较空白对照组与PD组,经美多芭处理后,大鼠抑郁程度并没有减轻而是明显加重,所以我们认为美多芭的摄入可以加重PD的抑郁情况。本研究强调了美多芭的影响,因为治疗剂量的美多芭可以明显增加纹状体之外大脑其他部分多巴胺(dopamine,DA)的释放。额叶皮质与海马都表达有DA受体,且与情绪与认知功能有关,美多芭引起的这些区域过量的神经递质DA的传递可能与PD治疗的运动与非运动并发症有关。同时,5-HT免疫组化染色结果显示,在美多芭组额叶与海马5-HT免疫反应明显弱于其他各组,所以,我们认为,美多芭的摄入可以导致额叶与海马5-HT水平的降低,美多芭组大鼠抑郁的加重与它导致5-HT水平的降低有关。5-HT是许多情感障碍异常研究的焦点,在PD患者与PD动物也受到关注。由于5-HT能神经元没有像黑质致密部DA能神经元相同的抗氧化机制,所以它们更容易受到L-dopa/DA合成及代谢的副产品如醌类物质的影响。有研究发现,5-HT能突触可以接受外源性L-dopa并将其转变为DA,作为假性神经递质(falseneurotransmitter)释放入纹状体。因此,美多芭组大鼠在DA能系统受损,摄入外源性L-dopa后,5-HT能神经元作为DA能神经元的替代品,将L-dopa转变为DA并将其释放到大脑中,这种行为是以失去正常的5-HT系统功能为代价的,在美多芭治疗后5-HT含量的降低,是抑郁发生的推动力。抑郁的发生与总体的认知功能及某些特殊的认知障碍有关。Zoccolella等总结了从1966年至2010年3月31日所有关于同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)与PD认知功能损害和痴呆关系的16项研究,大数研究中L-dopa治疗后HCY浓度升高,而血浆的HCY浓度与患者认知功能、痴呆、PD患者神经变性的标记物明显相关,进而可能导致抑郁的发生。但本实验并未对血浆HCY浓度进行测定,所以该结论需要进一步的研究来确定。安坦为中枢抗胆碱抗PD药,在PD中由于中枢神经系统DA能神经元的丢失,DA能系统功能减弱使胆碱能系统相对的增强,导致运动症状的发生,所以临床使用安坦,发挥其抗胆碱和治疗震颤的作用。在我国,尤其是农村地区,由于安坦价格便宜,而被广为应用。然而许多患者服用安坦后,出现口干、尿潴留、幻觉和认知功能减退等症状,但有关它对情感障碍尤其是抑郁的影响,仍未有报道。本研究结果显示,安坦治疗后的大鼠,较空白对照组与PD组大鼠表现出更明显的抑郁。但是安坦组与PD组、空白对照组、假手术组相比,5-HT在额叶与海马的表达没有明显差异,提示安坦对认知功能的影响不是通过改变大脑5-HT的水平来发挥作用。抑郁的产生,我们认为可能与安坦引起的其他并发症有关,如认知功能的减退。安坦可导致PD患者明显的认知功能减退,而抑郁的发生与总体的认知能力,及某些特殊的认