激活血管内皮细胞乙酰胆碱作用靶标对抗血栓形成的影响及其分子机制

激活血管内皮细胞乙酰胆碱作用靶标对抗血栓形成的影响及其分子机制

1865年，他首先提出了内部皮细胞（ec）的概念。自血管内皮细胞（tc）的功能范围仅限于阻止血管壁和物质交换的屏障。随着分子生物学等先进技术的应用,尤其是血管内皮舒张因子(EDRF)发现后,对EC功能的研究已成为心血管领域的研究热点。现已证明,EC与血栓形成密切相关,生理状态下,EC的非粘附的、抗凝的、纤溶的管腔内表面使其具有抗血栓形成特性。血栓状态下,EC被激活,抑栓物质如NO合成降低,eNOS表达下降,PGI2合成减少,t-PA、u-PA及其受体系统功能降低;而促栓物质如ET、PAI-1、TXA2等合成增加或活性增强。1980年Furchgott等在《Nature》上首次报道,在兔离体胸主动脉上,外源性给予乙酰胆碱(Ach)所产生的血管舒张反应依赖于完整内皮的存在,提示血管内皮细胞上存在可被Ach激活的血管内皮细胞乙酰胆碱靶标(theendothelialtargetforacetylcholine)。在血栓形成的早期,动脉的近心端血管内皮细胞乙酰胆碱靶标的功能极度低下。内皮细胞包括血管内皮细胞乙酰胆碱靶标有无可能作为抗血栓药物作用的新靶标?目前尚无相关的文献报道,至今国内外尚未见调节血管内皮细胞功能的抗血栓药物报道。本实验通过观察槟榔碱的抗血栓作用特点,旨在阐明激活血管内皮细胞乙酰胆碱靶标对血栓形成的影响并探讨其可能的分子机制。1材料表面1.1动物Wistar大鼠,♀♂兼用,体重200～250g;昆明种小鼠,♂,体重18～22g。均由军事医学科学院实验动物中心提供。1.2凝血酶时间测定kappa型角叉菜胶,槟榔碱,盐酸毛果芸香碱(Sigma公司);凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间测定试剂盒(福建太阳生物技术公司);PAI-1活性测定试剂盒(上海医科大学分子遗传学研究室),血栓素B2和6-酮-前列腺素放免测定试剂盒(解放军总医院东亚放免所)。2adp活性测定2.1小鼠尾动脉血栓模型的制备小鼠腹腔注射kappa型角叉菜胶5mg·kg-1后,饲养于(20±1)℃的温度和30%～50%的湿度环境中,于血栓启动前24h、1h和启动后24h分别ip受试药物,48h后统计成栓率和血栓长度。2.2富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)的制备Wistar大鼠,尾静脉注射槟榔碱后2h,于下腔静脉采血5ml(3.8g·L-1枸橼酸钠抗凝),800r·min-1离心10min,得PRP,再将下层3000r·min-1离心10min,得PPP。2.3血小板最大聚集率的测定取PRP,加20μmol·L-1的ADP外源性诱导血小板聚集,观察药物对最大聚集率的影响。2.4凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(KPTT)和凝血酶时间(TT)的测定取离心后的PPP,按试剂盒说明测定PT,KPTT和TT。2.5组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)含量和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)活性的测定2.5.1t−PA2.5.1t-ΡA抗原的测定用ELISA方法测定血浆中t-PA的含量。2.5.2PAI−12.5.2ΡAΙ-1活性的测定采用发色底物法,依试剂盒说明操作。2.6血栓素A2(TXA2)和前列环素(PGI2)的含量测定在血栓模型上,ip槟榔碱1.0和4.0mg·kg-1后48h,动物眼球采血(消炎痛-EDTA-Na2抗凝),于4℃,3000r·min-1离心15min,取上层血浆依试剂盒说明测定TXB2和6-keto-PGF1α的含量。2.7统计学处理成栓率的统计χ2检验,其它数据以x¯±sx¯±s表示,采用成组t检验(SAS软件,D2P8程序)。3结果3.1阿司匹林、槟榔碱和毛果英香碱对止血形成的影响3.1.1各组的84%对比阿司匹林25和50mg·kg-1,血栓发生率分别为32%和28%,与模型组的88%相比降低,P<0.01,(n=50);血栓长度分别为(6.4±1.2)mm和(9.6±2.2)mm,与模型组的(16.4±1.9)mm相比缩短,P<0.05及P<0.01(n=11～16),见Tab1。3.1.2血栓形成试验结果槟榔碱0.01～0.05mg·kg-1,成栓率分别为100%和93%,与模型组的95%相比,差异无显著性,P>0.05(n=40),血栓长度分别为(14.8±1.5)mm和(16.4±1.6)mm,与模型组的(19.5±2.2)mm相比也差异无显著性,P>0.05(n=40);当剂量增至0.1mg·kg-1后,血栓发生率为58%,与模型组88%相比降低,P<0.01(n=23);剂量增至1.0～4.0mg·kg-1时,成栓率呈剂量依赖性降低,抗栓作用强度达到峰值。其中4.0mg·kg-1,成栓率由88%降低为30%,P<0.01(n=40),血栓长度由(16.4±1.9)mm缩短至(6.2±1.2)mm,P<0.05(n=12)。见Tab1。3.1.3成栓率和血栓长度毛果芸香碱剂量为4.0mg·kg-1,比槟榔碱抗血栓的最低有效量0.1mg·kg-1高40倍后,使之充分激活M受体,成栓率和血栓长度分别为74%,(16.8±2.4)mm,与模型组的88%和(16.4±1.9)mm相比差异无显著性,P>0.05(n=37～50)。见Tab1。3.2两组t值的比较静脉注射槟榔碱1.0mg·kg-1后,TT、PT和KPTT值分别为38.81s,1.38s,26.95s,与正常对照组的37.60s,1.21s和27.22s比较均差异无显著性,P>0.05(n=4～15)。见Tab2。3.3大聚集率与正常对照组比较槟榔碱1.0mg·kg-1,血小板最大聚集率MAR为40.17%,与正常对照组的43.13%相比差异无显著性,P>0.05(n=6～15)。见Tab2。3.4血浆t-pa含量的比较静脉注射槟榔碱0.25和1.0mg·kg-1,血浆中t-PA的含量分别为116.23和107.10,与正常对照组的100.00相比升高,P<0.01和P<0.05(n=7～16)。见Fig1。3.5i-1的活性静脉注射槟榔碱1.0mg·kg-1,PAI-1的活性为16.86kU·L-1,与正常对照组的18.89kU·L-1相比明显降低,P<0.01(n=8)。见Fig2。3.6模型1:xb2含量槟榔碱1.0～4.0mg·kg-1,TXB2含量分别为356和346μg·L-1,与模型组的824μg·L-1相比降低,P<0.01(n=12～13)。见Fig3。3.7民法中的pge-pgf1含量槟榔碱0.25～1.0mg·kg-16-keto-PGF1α含量分别为488μg·L-1和428μg·L-1,与模型组的324μg·L-1相比明显升高,P<0.01(n=12)。见Fig4。4抗血栓作用的激活途径本实验研究发现,槟榔碱在0.1～4.0mg·kg-1剂量下,可剂量依赖性地对抗血栓形成,其抗栓强度为阿司匹林的250～500倍;而相同条件下,毛果芸香碱在剂量高达4.0mg·kg-1,较槟榔碱的最低有效剂量高40倍,使之充分激活M受体后,仍无抗血栓形成作用。本研究室近几年的系列研究发现:内皮细胞乙酰胆碱作用靶标与经典的M受体既有相似性又有差异性。二者的相似性表现为:均可被Ach激活,被氧化震颤素、槟榔碱和氨甲酰胆碱所模拟;M受体拮抗剂阿托品抗M和抗内皮细胞乙酰胆碱作用靶标的作用是平行的。二者的差异性表现为:毛果芸香碱不能激活内皮细胞乙酰胆碱作用靶标,但可激活M受体,阿托品不取代3H-Ach的特异性结合位点。在内皮完整的离体大鼠主动脉环上,槟榔碱可剂量依赖性地诱发内皮依赖性血管舒张反应,而在相同条件下毛果芸香碱无明显的舒血管作用,表明毛果芸香碱不能激活血管内皮细胞乙酰胆碱作用靶标,此规律存在于大鼠、猫和兔的主动脉,也存在于猫的主动脉、肠系膜动脉、股动脉和肾动脉上,具有一定的组织普遍性。另外,槟榔碱和毛果芸香碱均能激活平滑肌、神经元和腺体上的M受体。由此可见,毛果芸香碱选择性激活M受体,而无激活血管内皮细胞乙酰胆碱靶标的作用;而槟榔碱既激活血管内皮细胞乙酰胆碱靶标又激活M受体。因此,槟榔碱的抗血栓作用是激活血管内皮细胞乙酰胆碱靶标的结果,而不能用激活M受体来解释。综上所述,血管内皮细胞功能状态与血栓形成之间密切相关,特异性作用于内皮细胞,并激活血管内皮细胞乙酰胆碱靶标的药物,均可有效地对抗血栓形成。大量文献报道,激活血管内皮细胞乙酰胆碱靶标可促进其释放NO和PGI2,外源性激动剂如Ach、ATP、凝血酶等刺激血管内皮细胞后,L-精氨酸在NOS作用下生成NO,激活GC,使cGMP水平升高,引起平滑肌舒张,缓解血栓状态下血管的痉挛状态,并加快淤滞的血流;NO还可抑制血小板的聚集,抑制血小板与EC的粘附,对抗血栓时血管壁细胞增殖;NO还可通过抑制PAI-1从血小板释放而增加纤溶活性。Yao等在电刺激狗冠状动脉诱发血栓形成的动物模型上发现,预先给予NOS抑制剂L-NNA可使血栓形成的诱发时间缩短约20%,而预先给予NO前体L-Arg或NO供体硝普钠则血栓诱导时间延长1倍以上。一些机械刺激如血流剪切应力的变化;活性物质如5-HT、Ach、AA、凝血酶等均可使EC合成PGI2增多,EC摄取血液中的AA,经环氧合酶(COX)代谢途径先生成内过氧化物(PGH2),再经血管壁细胞微粒体中的前列环素合成酶作用生成PGI2,后者激活AC,使胞内cAMP升高,cAMP通过升高ATP依赖的蛋白激酶(PKA),磷酸化PLC;抑制与Ca2+连接的蛋白激酶的活性,降低血小板与平滑肌细胞内Ca2+浓度;减少纤维素与激活血小板上连接位点的结合等途径抑制血小板聚集,舒张血管平滑肌,抑制粘附分子与EC的粘附反应,PGI2还可引起t-PA从血管壁释放而激活纤溶,发挥抗血栓作用。本实验结果表明,槟榔碱可促进内皮细胞释放PGI2,通过上述途径抑制血栓形成。文献报道,对多种血栓模型,PGI2有抗血栓形成作用:给金黄地鼠局部应用低浓度PGI2,可抑制ADP引起的微血栓形成,PGI2对静注AA诱发的家兔肺微血栓有抑制作用,也可阻止电刺激家兔颈动脉壁所形成的血栓。除NO和PGI2外,激活血管内皮细胞乙酰胆碱靶标而发挥抗血栓作用还有其它途径如t-PA、PAI-1、TXA2等。t-PA主要由血管EC合成,在纤维蛋白的存在下,通过形成t-PA、纤溶酶原和纤维蛋白的三元复合物进一步增加t-PA与纤溶酶原的接触,也使激活的纤溶酶结合在复合物上,而不被α2-抗纤溶酶灭活;另外EC也合成t-PA的生理性抑制剂PAI-1,人们现已把血浆PAI-1视为血栓性疾病的独立危险因子。纤溶系统损害主要表现在两方面:一是血管EC释放t-PA下降,二是血浆中PAI-1浓度增高,抑制了t-PA的活性,后者表现的更显著。本实验中,槟榔碱可促进内皮细胞释放t-PA,抑制PAI-1的活性,通过上述环节发挥抗血栓作用。血小板的激活是动脉血栓形成的主要诱因,其粘附于受损血管部位与EC相互作用,始动血小板活化过程,并为瀑布式凝血反应提供场所,粘附的血小板变形并发生释放反应,将胞浆中所含颗粒内含物如TXA2释放到血浆,TXA2能强烈收缩血管,并诱导血小板聚集,TXA2与PGI2作用相反,二者之间的活性保持平衡,可控制正常的止血机制。槟榔碱可通过上述途径抑制血栓时TXA2的生成,增加EC释放PGI2,从而发挥抗血栓作用。目前现有的抗血栓药物依作用机制可分为抗凝血药、抗血小板药和纤维蛋白溶解药。抗凝血药包括肝素,AT-Ⅲ及直接抗凝血酶药,组织因子通路抑制剂等。其中肝素不能抑制与纤维蛋白结合的凝血酶,已成为血栓复发的关键因素。近年来,低相对分子质量肝素及凝血酶抑制剂的研制,虽使抗凝血药的疗效与安全性有所提高,但总的来说,尚无理想的抗凝血药供临床使用;抗血小板药包括环氧酶抑制剂,TXA2受体阻滞剂和TXA2合成酶抑制剂,血小板GPⅡb/Ⅲa受体阻滞剂等。此类药物或作用不强,或半衰期太短,或无法口服等,限制其广泛应用;纤维蛋白溶解药包括第1代的链激酶、尿激酶等,第2代的t-PA、阿尼普酶等,第3代制剂如改造野生型t-PA、组建嵌合型溶栓剂、单克隆抗体导向溶栓剂、葡萄糖球菌激酶等。此类药物虽经历3代的研制和发展,溶栓效果和特异性逐渐有所改善,但尚未取得本质性和突破性进展,有不同程度的出血、再灌注损伤、过敏反应等副作用和溶栓后再栓塞等缺陷,以及用药时机和剂量不宜掌握等问题。因此,研究有效、安全、适于长期使用的口服抗血栓药物具有重要意义。本实验结果表明,槟榔碱的抗血栓作用机制是促进内皮细胞释放PGI2等抑栓物质而通过舒张血管、抑制血小板聚集,加快淤滞的血流等环节起到抗血栓形成作用;促进内皮细胞释放t-PA,抑制PAI-1的活性,而间接激活纤溶系统