绿色木霉菌对黄瓜立枯病及枯萎病的防治效果

绿色木霉菌对黄瓜立枯病及枯萎病的防治效果

中国是世界上的主要蘑菇产区。然而，随着蘑菇产业的繁荣，也存在一些问题。它的副产品是令人难以置信的蘑菇。目前,蘑菇菌糠没有较好的回收利用手段,蘑菇生产后废弃的菌糠对环境将会造成一系列的严重后果,其传统的处理方法是丢弃或燃烧,不但造成资源浪费,同时导致霉菌和害虫滋生,从而造成环境污染。此外,废弃的平菇菌糠中还蕴藏着极其丰富的木霉,其中不乏生命力强及抗病性强的菌株,利用绿色木霉对废弃的菌糠进行发酵处理,生产大量的具有一定生防价值的发酵产品对资源的经济利用及环境保护都是有重要的意义。国内对菌糠利用的研究起步较晚,主要集中在将其二次利用栽培食用菌、直接作为有机肥料或土壤改良剂还田、经简单处理或发酵后作为动物饲料的研究探索等。相对而言,国外研究较为成熟,甚至已经涉及到环境保护、能量再生等方面。林怀忠等将菌糠粉碎后放在阳光下暴晒至适干,然后与腐熟的鸡粪、碳渣灰混合后直接对黄瓜、辣椒、番茄、茄子施用,其在生长期表现为叶色浓绿,叶片厚而挺拔,植株生长粗壮等优良性状。朱小平等研究了有益微生物与菌糠复合物对辣椒、菠菜、小白菜、不结球白菜等蔬菜产量及营养元素吸收和土壤养分转化的影响。结果表明,链霉菌和巨大芽孢杆菌与菌糠的复合肥料可以促进土壤养分转化、提高产量、增加营养元素吸收,还发现NaCl胁迫下施用含有链霉菌和巨大芽孢杆菌的菌糠复合肥料,有利于豌豆生长、促进结瘤、提高光合能力、提高产量。绿色木霉在植物真菌病害防治上一直都是人们所关注的焦点,然而如何通过简单廉价的方法大量获得却是实际应用的一大瓶颈。Michael在随机选取30个新鲜菌糠样品,进行了成分统计分析得到,菌糠中含有氮、磷、钾等大量营养元素,钙、镁、硫等中量营养元素,铜、锌、铁、锰等微量元素。这些营养元素有的是酶、维生素、激素的重要组成部分,或直接参与机体的代谢过程,能够提高植物酶的活性,或对微生物的关键代谢存在一定的调节作用。而且菌糠中丰富的有机质,大量的碳源,在适量添加氮源后即可用来培养微生物。本研究中用到的绿色木霉是本实验室经过大量筛选试验从平菇菌糠中获得的一株对立枯丝核菌及尖孢镰刀菌有较强抗性的菌株(LTR-2),将其分别采用不同培养方法大量获得后接种到菌糠上,考察了其对黄瓜立枯病及枯萎病的防治效果。在确定利用少量灭菌菌糠培养后获得的发酵产物能够较好地对两种病害具有较高防效的同时,又对其在拌土比例和拌土堆置时间的条件优化上进行进一步的实验。创新之处在于大量菌糠发酵时模拟田间实际环境条件,采用堆肥管理,这样能够在较短时间、较为简单的操作控制下获得发酵产品,便于指导实际生产。此外,生防菌株绿色木霉亦来自菌糠,从而具有一定的生长优势,通过两者的结合使用,既获得了大量的生防因子,同时又处理了一些废弃物,对未来绿色农业生产的价值不言而喻。1材料和方法1.1材料与培养方法供试菌种:绿色木霉(Trichodermaviride)LTR-2,立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani),尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum),由中国农业科学院蔬菜所综防课题组保存。培养基:PDA培养基(马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂18g,水1000mL),PD培养基(马铃薯200g,葡萄糖20g,水1000mL)。供试黄瓜品种为中农6号,栽培土来自中国农业科学院蔬菜所综防课题组温室大棚。病原菌菌悬液制备:将立枯丝核菌接种到PD培养基在25℃培养箱培养,然后将其在630nm下调节至吸光度为3.46%的病原菌菌悬液,尖孢镰刀菌则制成浓度为3×106个/mL的孢子菌悬液。绿色木霉的制备:将在PDA上培养的绿色木霉配成109个/mL的孢子菌悬液;绿色木霉在PD培养基上摇床培养,培养液双层纱布过滤除去菌丝,制成浓度为109个/mL的孢子悬液;少量菌糠灭菌后接种绿色木霉,培养5～7d后将其转接到大量未进行灭菌处理的菌糠上,进行堆肥管理,调查孢子浓度为109个/g备用[10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20]。种子处理:将黄瓜种子用清水冲洗,然后浸泡12h,放在28℃恒温箱催芽,当胚根长至1cm左右时进行种苗。1.2测试方法1.2.1抗性菌木霉的培养分别挑取立枯丝核菌与尖孢镰刀菌菌丝接种于两个不同PDA平板中央,28℃下培养1d后分别在离病原菌约2cm处接种拮抗菌绿色木霉,28℃下再培养4d,观察抑菌带宽度,每个处理3次重复。1.2.2混合木霉pd发酵物与栽培土混中酵母粉的制备菌糠发酵物与未发酵菌糠分别按照10%的添加比例与栽培土混拌均匀,绿色木霉PD发酵物与绿色木霉孢子菌悬液也与栽培土混拌均匀(保证其孢子浓度与菌糠发酵物的孢子浓度一致)。只含栽培土基质作为对照,以上每组处理分别分装于50个栽培砵。1.2.3绿色木霉素的比例对黄瓜的消毒菌糠发酵物的拌土比例分别为2%、5%、10%、15%、20%,只含栽培土基质作为对照组处理,以上每组处理分别分装于50个栽培砵。1.2.4绿色木霉菌糠对黄瓜枯涣病的防治试验菌糠发酵物的添加比例为10%,分别拌土堆置0、3、6、9、15d后备用,只含栽培土基质作为对照,以上每组处理分别分装50个栽培砵。绿色木霉菌糠发酵物对黄瓜枯萎病的防治试验方法与立枯病相同,将黄瓜种子播种于装好的栽培砵中,然后在栽培砵中分别注入已配制好的病原菌菌悬液,以上每个处理5次重复,每次重复10株苗。3～5d出芽后调查发病情况,并计算防治效果。试验数据采用Excel2003进行处理分析。2结果与分析2.1菌的抗性作用从表1可以看出,绿色木霉对立枯丝核菌和尖孢镰刀菌两种病原菌都存在较强的拮抗作用,分别达到了66.8%及87.5%,其对病原菌的拮抗作用一般表现为竞争重寄生。其平板试验也可观察到其与病原菌相互缠绕,交界处其病原菌萎缩或生长受限。2.2菌糠和黄瓜的生长特性绿色木霉菌糠发酵物对黄瓜立枯病及枯萎病的防治效果达到75.2%和65.3%(图1),分别高于绿色木霉PD培养基发酵物接种方式和绿色木霉菌悬液接种方式的防效。主要利用了绿色木霉分离于菌糠这一特点,由此,在少量灭菌菌糠中接种绿色木霉,其会快速生长,也就是说获得了一定量的具有绿色木霉生长优势的种子菌糠,相对其他接种方式自然更利于绿色木霉的稳定生长。需要指出的是未发酵菌糠对黄瓜立枯病的防治也能起到一定的效果。菌糠含有较为丰富的有机质、酶类、残余菌丝等,在对绿色木霉的生长定植及有效抗性产物代谢方面起到一定的积极意义,从而对两种病害具有相对较高的防治效果。菌糠具有很好的通透性和保水性,能有效地改善了土壤理化性状和微生态环境,为作物根系创造较好的生长环境,本身被代谢降解后,释放一些物质可能对黄瓜植株本身防御病害能力起到一个提高的作用。2.3菌糠和其他添加比例对植株生长和电导率的影响绿色木霉菌糠发酵物的添加比例直接影响其生防因子的数量,但由于菌糠各种理化指标的局限性,其添加量并不是越多越好。可以看出其添加量为10%时对病害的防效达到78.3%和71.4%(图2),高于其他添加比例的抗病效果。菌糠一方面能为绿色木霉提供一个较为理想的定植环境,但过量的菌糠引入会导致植株生长环境中营养元素、碳氮源比例等的改变,打破这样一个稳定的微环境可能对其生长产生负面影响。在整个发酵过程中,不排除产生其他微生物,过量引入则导致其他非可控因素影响的增加,实际应用中过高比例的添加量也缺乏应用前景,关键还是在于尽量用较少菌糠获得大量绿色木霉(即较高的孢子浓度)。其菌糠中相对较高的电导率对植株生长也并不是十分有利。菌糠添加量较小,则生防菌的含量也随之减少,达不到对病害较好的防治效果。2.4绿色木霉的生长绿色木霉菌糠发酵产物拌土时间为6d时,其对黄瓜立枯病及枯萎病的防治效果较好,分别达到85.6%和74.3%(图3)。拌土时间较短,则不利于绿色木霉的定植,未适应新环境的同时对病害的防治效果自然不高。拌土时间太长则影响其绿色木霉抗病活性,或积累一些对植株生长不利的次级代谢产物,菌糠的长时间堆置势必会滋生其他微生物,严重影响其发酵菌糠的品质,实际应用中会造成利用效率大大降低。3不同种类菌糠防治效果绿色木霉与菌糠的结合利用在黄瓜立枯病及枯萎病的防治和植株生长上具有一定的积极作用,通过对其应用方式的研究可知,其最佳处理方式为绿色木霉接种菌糠发酵,拌土比例10%且堆置6d后对两种病害具有较高防效,这与高苇的研究结果相近。Choi等认为在防治仙人掌茎腐病的研究上,在接种病菌的土壤中,菌糠的加入有助于降低发病率3%～12%,而未加入菌糠接种病菌土壤的发病率为44%～59%,本研究也显示了未发酵菌糠对两种病害存在一定的防效,菌糠本身富含大量营养元素,还存在一些菇类残余菌丝或一些抗病相关的次级代谢产物,其疏松多孔、优良的保水性等特点对植物生长有着一定的积极作用。菌糠的种类较多,成分更是复杂,本研究则针对平菇菌糠,实际应用中搞清楚其背景至关重要,不同种类菌糠在应用中也存在一定的差异。生物制品的稳定性问题至今仍是很难攻克,当然,绿色木霉发酵菌糠也不例外,因此,寻找抗逆性更高的微生物菌株,或采取突变育种、分子生物学等技术以提高其应对环境变化的能力。本研究对绿色木霉菌糠发酵物抗病效果仅考虑其生防因子的浓度,而忽略了对其代谢产物,以及是否促进有益微生物共生而起到抗病能力的研究,主要是在相对粗放的条件控制下,孢子浓度的测量较为简单直观,大量研究也表明绿色木霉对真菌的防治主要是其重寄生、抗生及竞争作用,这些特点都与其浓度存在正相关性。相关研究表明,绿色木霉还能提高防御酶的活性,诱导酚类物质和木质素的合成,生物土壤添加剂的应用还能显著提高根系脱氢酶的活性,脱氢酶