利用蔗糖密度梯度离心法纯化伪狂犬病毒

利用蔗糖密度梯度离心法纯化伪狂犬病毒

真菌病毒（prv）也被称为假性病毒（prv），属于官僚病毒甲科植物。伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的家畜和多种野生动物的一种以发热、奇痒、呼吸和神经系统疾病为特征的急性传染病,又称Aujeszky病,在世界各地流行。伪狂犬病毒可引起猪、牛、羊、犬、猫、家兔、小白鼠、水貂、狐等多种家畜和野生动物发病,具有高致死率。而猪是该病毒增殖感染唯一可存活的宿主,是该病毒的自然储存库。所以,从猪群中切断伪狂犬病毒的传播是控制伪狂犬病的有效途径。到目前为止,已有24个省市先后报道该病,给我国养殖业造成了巨大的经济损失。并且,猪感染伪狂犬病毒后,免疫系统受到损害,容易继发感染其他疾病,如猪瘟、猪繁殖与呼吸障碍综合征等,给猪伪狂犬病的防治增加了难度,也给猪病防治提出了新的课题。本研究纯化并鉴定伪狂犬病毒,旨在为今后利用其建立杂交瘤细胞株,获得伪狂犬病毒单克隆抗体以及建立特异的病原诊断方法奠定基础。1材料和方法1.1低分子质量标准蛋白质Taq酶、基因组DNA提取试剂盒为大连宝生物工程有限公司产品;引物合成和序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成;低分子质量标准蛋白质为上海丽珠东风生物技术有限公司产品;犊牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;伪狂犬病毒Bartha株购自中国兽医药监察所;HITACHICR-21GⅡ高速离心机、HITACHICP-100WX超速离心机、DMEM培养基购自美国英杰生命技术有限公司。1.2方法1.2.1狂犬病毒bartha的培养过程用含10%犊牛血清的DMEM培养幼仓鼠肾细胞(BHK-21)使其生长至单层后,接种适当稀释的伪狂犬病毒Bartha株1mL,于5%CO2、37℃条件下孵育1h后,每瓶加8~10mL含2%犊牛血清的DMEM维持液,培养60h后收获。第1代无典型细胞病变,盲传2代后,开始出现典型的细胞病变,传至21代,都出现典型的细胞病变。将BHK-21细胞培养物反复冻融3次后收集,置-20℃备用。1.2.2基因组dna提取将病毒的细胞培养液反复冻融3次后,以5000r/min离心30min,取沉淀,按基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA,-20℃保存备用。1.2.3pcr扩增过程根据参考文献合成1对引物,上游引物P1:5′-CACGGAGGACGAGCT-GGGGCT-3′,下游引物P2:5′-GTCCACGCCCCGCT-TGAAGCT-3′,以提取的病毒DNA为模板进行PCR扩增,扩增长度为217bp。PCR反应体系为20μL,循环参数为:94℃预变性4min;94℃1min,65℃1min,72℃1min,30个循环;最后72℃延伸10min。扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。1.2.4设立2%微生物指标将冻融的PRV细胞培养液做10倍系列稀释,接种至已铺满单层BHK-21细胞的96孔培养板中,每稀释度接种8孔,于5%CO2、37℃条件下吸附1h。最后3列作为对照组,每孔加0.1mLPBS。然后按0.1mL/孔加入2%犊牛血清的DMEM。于5%CO2、37℃条件下培养。每日观察记录细胞病变情况,144h后终判,按Karber法计算病毒滴度。1.3沉淀用微胶凝剂pbs细胞培养物于4℃下8000r/min离心30min,取上清,再在4℃下25000r/min离心2.5h,沉淀用少量0.01mol/LPBS(pH7.2)重悬。以PBS配制质量分数为30%、35%、40%、45%的不连续蔗糖梯度溶液,加样品至梯度界面上,4℃、26000r/min离心2h,吸取蛋白带至离心管内,加PBS以30000r/min离心1h去蔗糖,沉淀以PBS溶解,-80℃保存备用。1.4病毒蛋白质含量的测定利用752型紫外光栅分光光度仪(上海第三分析仪器厂),测定260nm和280nm波长处病毒样品的OD值。1.5直平板电泳将病毒样品煮沸变性后,进行SDS垂直平板电泳。60mA电压下电泳约3h,用考马斯亮蓝R250染色2~4h。参照标准分子质量蛋白迁移率,测算出病毒样品电泳条带对应的分子质量。2结果与分析2.1prv在brk细胞上的增殖培养BHK细胞接种PRV后,第1代细胞无特异性病变出现,盲传2代后,开始出现特异性的细胞变圆、脱落,形成合胞体的病变(图1)。这说明PRV在BHK细胞中复制并增殖,对细胞的生长产生了特定的影响。由琼脂糖凝胶电泳图谱可见,在217bp左右处出现1条与预期大小一致的条带(图2)。测序也证实待纯化的细胞液中确实存在猪伪狂犬病毒。2.2稀释度的确定Karber法计算病毒滴度公式为:lgTCID50=L-d(s-0.5),其中L=最高稀释度的对数;d=稀释对数之间的差;s=阳性管比率总和。根据表1中数据,得lgTCID50=L-d(s-0.5)=-1-1×(1.75-0.5)=-2.25,病毒滴度为103.25TCID50/mL,所得病毒毒力偏低,可能是由于培养病毒时所加维持液偏多的缘故。2.3采后感染的猪伪狂犬病毒的细胞系统接毒的BHK-21细胞电泳条带与未接毒细胞相比,在40kD附近出现了2条新增条带(图3),这2条带在提纯的病毒中依然存在。这表明在接毒后,细胞内的蛋白组成已经发生变化,这些新增的蛋白很可能是组成病毒的蛋白。提纯病毒共出现5条蛋白带,分子质量为30~97kD,其蛋白大小与报道的猪伪狂犬病毒各蛋白大小基本相当。由图3可见,经蔗糖密度梯度离心后,病毒纯度有明显提高。3brk-21细胞增殖特点一般采用在低倍显微镜下观察细胞病变来判断病毒是否在细胞系中增殖。细胞病变是病毒在细胞内增殖及其对细胞产生损害的最明显的表现,包括胞浆的颗粒变性、胞核的变形和碎裂等,而且经常导致细胞的完全破坏。细胞病变的出现,一般可认为是病毒增殖的确切证据。接毒BHK-21细胞出现了明显的细胞变圆,脱落,形成合胞体的特异性病变。病毒样品经超速离心浓缩和蔗糖密度梯度离心后,每一界面均