杨树组织培养及转化技术的研究进展

杨树组织培养及转化技术的研究进展

柳树分布广泛，适应性强。它不仅是一个重要的经济树种，而且在土壤和水的保护和生态平衡方面发挥着重要作用。以往人们采用传统育种方法来改良杨树品种,但工序复杂,费时费工,且受气候、地域和水分等多种环境因素的限制。随着分子生物学的发展和杨树组织培养技术的日趋成熟,人们纷纷把目光转向基因工程,希望在短期内达到改良杨树品种的目的。此外,由于杨树生长周期短,离体操作容易,基因组相对较小,被喻作林木中的“烟草”,对研究林木的生理及遗传特性具一定的意义,使杨树的组织培养及其基因工程研究备受关注,进展迅速。下面就此作一简要综述。1器官培养替代依靠型树种开展造林早期主要是进行杨树愈伤组织培养这是由于愈伤组织易获得且易保存但从愈伤的诱导到获得完整植株所需时间长,培养程序复杂,易发生变异,不利于保持亲本性状也不利于扩大繁殖。为了大量繁殖优良树种,愈伤培养逐渐被器官培养所替代。通过器官培养不仅对幼嫩植株还对成熟林木实现了扩繁,其中芽的组织培养比较稳定,变异率低,在杨树的组织培养中较为常用。至今杨树已成为林木组织培养中研究最为广泛的树种之一。以下概述杨树组织培养的影响因素及其应用。1.1不同品种树种的诱导,其生长和形态、组织、生理特征影响着不同植株的再生能力理论上每一个植物细胞都具有再生成完整植株的能力,即细胞全能性。但在实际应用中,组织的再生受植株基因型、性别及年龄、组织来源、生理状态等多种因素的影响。(1)植株的基因型起决定性作用。不同基因型的植株,其再生能力有很大差别。Colemanetal(ColemanandErnst,1989)将16种不同基因型的美洲黑杨(P.deltoides)茎段接种在附加0.5mg·L-1ZT的培养基中,有6种难诱导,4种诱导率达50%以上,其余6种则介于3%至23%之间。(2)杨树属于雌雄异株植物,有些杨树的再生能力与性别有关,如缘毛杨(P.ciliata)的雌株再生能力比雄株高(Pierik,1987)。不过这种差异不是绝对的,白杨及其杂交系的雄株和雌株(16～30年)上的芽的再生能力就没有显著差别(Ahuja,1993)。(3)植株年龄对组织的再生有影响。通常幼嫩植株的芽比成熟植株的再生能力强。这可能是幼嫩植株分生能力旺盛的结果。但林木不同于草本植物,生长周期长,幼苗成年后的性状不易预测,有时不得不从成年的优良大树上直接选取幼嫩部分或先复幼再取外植体。一般来说,外植体越幼嫩,植株越容易再生(朱大保,1990)。(4)同一植株上不同器官的再生能力有所不同。如白杨及白杨杂交系的实生苗,其下胚轴和茎尖分化芽的能力高于子叶和叶片(Ahuja,1993)。即使同一器官的不同部位,再生能力也有差异。陈维伦等(1980)对山新杨(P.davidiana×P.bolleanaLoucne)叶外植体分化的研究表明,带有叶柄的下段(极易在叶柄的切口上形成芽)分化成芽的频率最高,达70%左右,而中、上段(芽从叶脉上产生)的分化频率极低。(5)不同生理状态的外植体对生长素和细胞分裂素的敏感度不同。郑均宝等(1995)用生根和未生根试管植株的叶片进行芽的诱导,发现生长条件一致时,生根试管植株的叶片分化情况较好,产生的不定芽数量多且粗壮。1.2培养基的选择培养基种类、盐浓度、生长调节物质、碳水化合物、光照和温度等外界环境因素对植株的再生有很大影响。(1)培养基种类和盐浓度。杨树组织培养中,MS和WPM培养基较为常用。它们富含植物所需的盐类,其中MS又可按盐浓度分为1/4MS、1/2MS和MS。1/4MS和1/2MS在诱导杨树试管苗生根时常用。这是由于高盐浓度对某些杨树的生根不利。此外还有一种大量元素减半的1/2MS培养基,主要用于芽的诱导。虽然MS和WPM在杨树的组织培养中常用,但都含较高浓度的铵离子。在有些杨树如杂交杨(P.alba×P.tremula)和杂交杨(P.trichocarpa×P.deltoides)的组织培养过程中,铵离子会富集在叶或茎段内,不利于愈伤组织的诱导(DeBlock,1990)。因此应根据材料来源、实验目的来选择培养基。(2)生长调节物质。组织培养中常用的有生长素和细胞分裂素两大类。生长素主要促进细胞分裂诱导愈伤组织产生和促进生根等在杨树上常用的有和2,4＿D。NAA和IBA广泛用于杨树的生根,并能与细胞分裂素互作促进芽的增殖。2,4＿D对杨树愈伤组织的诱导有效,对器官的分化不利。细胞分裂素主要促进细胞分裂、改变顶端优势和促进芽的分化等。杨树上常用的有KT、6＿BA、ZT和2＿ip等。6＿BA在杨树芽的诱导方面应用很广,已诱导十余种杨树成苗,但也有报道认为它不利于某些杨再生芽(Howeetal,1994)。此外,类细胞分裂素TDZ也正被用于杨树的组织培养。它促进腋芽增殖和不定芽分化,阻碍芽的伸长(HuettemanandPreece,1993),在杨树组织培养中应用潜力很大。极低浓度时就可诱导毛白杨叶外植体产生大量的芽。与BA(0.25mg·L-1)混合使用诱导芽分化时,用低浓度的TDZ(0.005mg·L-1)代替价格昂贵的玉米素(0.25mg·L-1),可达到或超过玉米素的效果(陈维伦等,1991)。除生长素与细胞分裂素外,其他生长调节物质对植物的生长也有一定影响。如GA,尽管它不促进杨树芽的分化,但可促进芽的伸长生长。(3)碳水化合物,光照和温度。通常杨树组培中使用蔗糖,用量为2.0～3.0g/L。为了促进毛白杨休眠芽生长,也有使用果糖作碳源的(陈维伦等,1983)。光周期由植株的生理特性决定,以16h光照居多,24h或12h光照也有报道。光强影响某些杨树的形态发生。有时弱光或全黑,会促进愈伤组织分化和根的再生(朱大保,1990)。温度对杨树植株的生长也有一定的影响。温度过高会导致分化芽出现玻璃化苗,低则苗生长缓慢。1.3组培苗的保存和利用组织培养在杨树上的应用主要表现在以下几个方面:第一,难生根树种的扩大繁殖。如白杨系,因根蘖繁殖率低、扦插生根难而难以运用传统方法大量繁殖。若用组织培养的方法,通过改变外植体的生长条件,则可在短期内获得大量组培苗。第二,种质保存。运用组织培养的方法,控制植株的生长速度,不仅能避免种质资源受病虫害的侵袭,还能节省人力和空间。此外,杨树组织培养系统可作为一种模式体系,来分析基因转移、体细胞变异和种质保存等方面存在的问题,研究林木生长、分化及幼嫩、成熟和复幼的分子机制。2法1方法在杨树的转化中,DNA直接转移法和农杆菌介导法都有应用,但后者较为常用。这是由于(1)杨树是农杆菌的天然宿主,且对农杆菌敏感;(2)杨树组织培养技术较为简单,受体系统的建立较为容易。2.1采用外源基因整合的基因植株DNA直接转移法是指裸露的DNA分子经特殊处理后,直接转移到原生质体、细胞或组织中。其中用于杨树转化的有PEG法、电击法和基因枪法等。王善平等(1991)以小叶杨(P.simonii)和欧美杨(P.deltoides×P.nigra)的叶肉原生质体为受体,在PEG和Ca2+的作用下,将含有GUS基因的质粒DNA转入原生质体。GUS瞬时表达结果证明,外源基因在这些原生质体中均得到表达。Chupeauetal(1994)采用电击法将携带新霉素磷酸转移酶基因(NptII)、乙酰乳酸合成酶的突变基因(Als)或人工合成的乙酰转移酶基因(Pat)的质粒DNA导入杂交杨(P.tremula×P.alba)叶肉原生质体,通过筛选获得外源基因整合的转基因植株。李铃等(2000)用基因枪法将烟草花粉绒毡层特异表达启动子TA29与芽胞杆菌酶基因基因构成的嵌合基因导入含基因的欧洲黑杨试管苗幼叶,经筛选和分子检测,获得阳性转化植株,实现了二次转化。她们发现选择发育适宜的叶片至关重要,过于幼嫩的叶片,轰击后损伤严重,失去再生能力,而老叶片转化后不易再生。以上这些方法皆有其优缺点。基因枪法受体材料的选择范围广,但要求的设备较昂贵;PEG法和电击法需要以原生质体为受体,而杨树原生质体培养技术还不成熟,限制了它们的应用。2.2几种常见病毒品种的转化农杆菌转化植物细胞是通过将其体内的一段DNA(T＿DNA)转移至被侵染的细胞而实现的,是一种生物学的转化方法。用此法导入的基因拷贝数少,利于避免基因沉默。影响杨树农杆菌转化的因素主要有:(1)农杆菌的类型。在杨树转化中常用的是土壤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens),其中胭脂碱型菌株C58的使用较为普遍。这是由于C58对杂交杨的侵染具普遍性,不过它的侵染强度有差异。在某些杂交杨的实生苗中,子代受C58侵染的强度随母本基因型的不同而不同(Riemenschneider,1990)。一般林木对胭脂碱型菌株的敏感度高于对章鱼碱型菌株的敏感度(Ahuja,1988),但这并不是绝对的,杨树对章鱼碱型菌株LBA4404的敏感度就较高,因此LBA4404也常用于杨树的转化。(2)植株基因型。大量实验表明,基因转化频率随植株基因型的不同而异,如黑杨无性系JeanPouret比SanGiorgio(Confalonierietal,1997)、毛白杨无性系1285雌株和毛新杨×毛白杨杂种比1319雄株容易转化(郝贵霞等,1999)。这可能是植株对侵染菌株的敏感度不同所致。(3)菌液浓度、侵染时间和共培养时间。在杨树的转化中,农杆菌菌液的浓度和侵染时间应适当。时间一般为10～60min。侵染时间过长或菌液浓度过高,外植体将褐化死亡;侵染时间过短或菌液浓度过低,附着于外植体切口处的农杆菌不足,转化频率将大大降低。郝贵霞等(1999)以杂交杨(毛新杨×毛白杨)为材料研究发现,当菌液的OD600为0.2或0.4,侵染时间10～20min时,卡那抗性芽的产生频率较高;当菌液浓度过高或过低、侵染时间过长或过短时,抗性芽的产生频率明显降低,有时甚至无抗性芽产生。此外,共培养时间的长短,直接影响目的基因的整合及转化细胞的数量。(4)酚类物质。植物受伤细胞分泌的某些酚类化合物可诱导农杆菌vir基因表达,促进T＿DNA转移(李洪清和李美茹,1999)。为了提高某些杨树的转化率,转化过程中往往加入一定的酚类物质。酚类物质的诱导效果与菌株、菌液浓度、植物材料和共培养培养基的pH值有关(郝贵霞等,1999;HuangandLi,1994)。转化杂交杨NC＿5331时,在经50倍稀释的菌液中加入25μmol/L或50μmol/L乙酰丁香酮,可获得较高的转化率(HuangandLi,1994)。(5)选择药物。一些杨树无性系对抗生素如卡那霉素和利福平等极为敏感,不利于转基因组织的分化或生根。因此要采用合适的选择标记基因、合适的抗生素浓度来筛选转化子体3杨树互补基因工程的应用3.1抗虫基因缺失基因杨树不仅是重要的经济树种,还是防护林的重要组成部分,但杨树害虫种类多,利用基因工程技术培育抗虫杨树,将是害虫防治的有效手段。目前在杨树上应用的抗虫基因主要有两类:一是从微生物苏云金杆菌中分离出的苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因,简称Bt毒蛋白基因;二是从植物中分离出的昆虫蛋白酶抑制剂基因。Bt毒蛋白是一类既具快速杀伤作用又能抑制昆虫生长和延迟发育的蛋白,已在741杨(郑均宝等,1995)、杂交杨(Howeetal,1994)、欧洲黑杨(田颖川等,1993)等杨树抗虫育种中得到应用。如将其编码基因导入欧洲黑杨的叶外植体,可获得含有Bt毒蛋白的转基因植株。杨尺蠖的毒力测定表明,5～9天内死亡率达80%～96%,存活的昆虫生长和发育受到明显抑制(田颖川等,1993)。不过Bt毒蛋白基因的杀虫谱带较窄,且易诱导昆虫对其产生耐受性。胰蛋白酶抑制剂可与胰蛋白酶的活性部位结合,抑制胰蛋白酶的活性,从而干扰昆虫的代谢,引起昆虫死亡。它具广谱杀虫的特点,且对人体无害,在抗虫基因工程育种中备受重视。目前导入杨树的有水稻巯基蛋白酶抑制剂基因(OD＿I)、豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)(郝贵霞等,1999)和马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因(Pin＿Ⅱ)(Klopfenstein,1993)等,其中转Pin＿Ⅱ基因植株已进入田间抗虫试验阶段。此外,为解决昆虫易对单个抗虫基因产生耐受性的问题,人们开始将多个不同类型的基因同时导入植物中。用农杆菌介导法将部分改造的BtCryAc基因与慈姑蛋白酶抑制剂(API)基因构建的双抗虫基因表达载体导入741毛白杨,分子生物学检测结果证明已得到转基因植株(郑均宝等,2000)。用农杆菌介导二次转化的方法将蛋白酶抑制剂基因(PI)导入含Bt基因的转基因欧洲黑杨,杀虫试验结果表明含有双抗基因的植株的抗虫能力明显高于仅含Bt基因的植株(李明亮等,2000)。3.2几丁质酶和防御素基因包括抗病基因和抗菌基因研究。在抗病基因研究中,主要涉及病毒外壳蛋白基因。其原理是通过外壳蛋白基因的导入,借助交叉保护作用的原理,达到降低病毒侵染的目的。在杨树上应用的抗菌基因有几丁质酶基因、抗菌肽基因和防御素基因。将几丁质酶基因导入杨树后,受体细胞几丁质酶含量上升,通过几丁质酶对真菌或细菌细胞壁成分几丁质的降解,可达到抑菌目的。将抗菌肽基因导入杨树并表达后,产生的蛋白可杀死消化道中帮助天牛消化木材纤维的细菌,从而杀死蛀干害虫光肩星天牛,杀虫率达70%以上(李玮等,1996)。防御素是广泛存在于动植物中的一类广谱微生物抗性肽。兔防御素NP＿1基因已被导入毛白杨(P.tomentosacarr)。转基因植株组织提取液对枯草杆菌、农杆菌和立枯病原菌等多种微生物的生长均有不同程度的抑制作用(赵世民等,1999)。3.3木质素的基因表达木质素是一种复杂的酚类聚合体,在植物体内含量仅次于纤维素,为第二丰富的物质,具有重要作用。但在以植物为原料生产纸张的过程中,需使用大量烧碱等化学试剂来除去木质素产生造纸废液因此原料中的木质素是造纸污染的源头原因宋艳茹等1999)。杨树是重要的造纸原料,降低其木质素含量或改变木质素的组成,将减轻造纸废水对环境的污染。人们已相继从多种植物中克隆出参与木质素生物合成的苯丙氨酸裂解酶(PAL)、咖啡酰辅酶A甲基转移酶(CCoAOMT)、肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)、4＿香豆酸∶CoA连接酶(4CL)和肉桂酰乙醇脱氢酶(CAD)等的编码基因(卢善发和宋艳茹,1999)。这些基因的克隆为利用植物基因工程降低木质素含量,改变木质素组成创造了条件。至今已将4CL、CAD和豆科植物的阳离字氧化酶基因(Sphx6a)反义导入白杨(P.tremuloidesMichx)(Huetal,1999)、欧洲山杨(P.tremula)(Lapierreetal,1999)和杂交杨(P.tremula×P.alba)(Ipekcletal,1999)。4CL和Sphx6a的反义抑制能使木质素含量分别下降45%和10%～20%。CAD基因反义表达虽然不能使木材中木质素含量明显降低,却能改变其组成,利于造纸工业中木质素的去除。由此可见,利用基因工程技术,对造纸原料木质素的生物合成进行调控,可提高木材质量,减少造纸废水污染,保护生态环境,实现生态效益和经济效益的统一。目前,我们实验室正与其他单位合作,选择2～3个靶基因,希望通过反义RNA技术,对毛白杨等造纸资源植物木质素合成途径进行调节,以致力于源头防治造纸废水污染的清洁生产,为资源开发与环境保护做出贡献。3.4rolc基因在形成层区的表达利用基因工程技术,将激素合成相关基因导入杨树,研究激素与林木器官发育的关系,将有助于达到促进林木生长的目的。IAA的极性运输对林木维管形成层结构的保持和分裂有至关重要的作用,而维管形成层的分裂又直接影响茎的次生生长,因此对形成层中IAA含量和分布的研究将有利于木材品质的改良。Tuominen等(1995)将与生长素合成有关的iaaM和iaaH基因导入杂交杨(P.tremulaL.×P.tremuloidesMichx.),得到18个两基因都表达的转基因株系。其中的两个株系中IAA分布发生改变,尤其在成熟的叶片和根部,IAA的含量升高,同时伴随木材解剖学的变化,包括维管直径缩小,维管密度增加,射线发育模式的改变。为研究IAA浓度变化和分布模式改变对形成层组织的影响,他们(Tuominenetal,2000)将带有能在形成层区特异性表达的rolC启动子的iaaM基因导入杂交杨(P.tremulaL.×P.tremuloidesMichx.),对转基因杨形成层区微量分析后发现,虽然形成层区IAA的浓度增加35%至40%,但由于IAA径向分布模式未改变,使得形成层衍生物发育模式和生长速率没有任何改变,说明尽管IAA的绝对浓度对形成层生长有一定影响,但它在形成层组织中的径向分布模式对林木的生长影响更大。上述结果为利用基因工程手段调整林木内部激素的分布,改良木材特性提供可能。细胞分裂素对杨树的分化和生长也至关重要。王善平等(1990)将T＿DNA中与细胞分裂素合成有关的4号基因引入毛白杨(P.tomentosa)并得到一些畸形芽。进一步研究发现这些畸形芽的内源细胞分裂素含量明显高于未转化植物。Nilsson(1996)