植物组织培养过程中褐变的机理及克服方法

植物组织培养过程中褐变的机理及克服方法

植物组织培养不仅包括使用人工培养基在无菌条件下培养植物组织，还包括从原始体、浮游生物和植物器官中培养。在植物组织培养过程中常遇到的问题是褐变,目前已在许多植物的组织培养中发现有褐变现象,尤以木本植物组织培养中褐变严重。褐变主要发生在外植体,在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生,褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐,而且对许多酶有抑制作用,从而影响培养材料的生长与分化,严重时甚至导致死亡。为此,我们结合近年的科研进展,探讨了植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及克服方法。1培养基及培养条件对愈伤组织的影响影响植物组织培养褐变的因子是复杂的,随植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等的不同,褐变的程度也有所不同。1.1植物种类及基因型在红豆杉愈伤组织的诱导及继代培养过程中,常常发生培养细胞褐变现象,轻者影响细胞生长和繁殖,重者导致细胞死亡。豆科植物和芸苔属植物原生质体培养中容易褐化也是一个普遍的问题,褐化现象在芸苔及其衍生的种或变种中似更严重。在橡胶的花药培养中,海垦2号花药的褐变较少,因而愈伤组织的诱导1.2外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同,接种后褐变的程度也不同。用荔枝无菌苗不同组织的诱导试验表明,茎最容易诱导出愈伤组织,培养2周后长出浅黄色的愈伤组织;叶大部分不能产生愈伤组织,诱导出的愈伤组织中度褐变;而根极大部分不产生愈伤组织,诱导出的愈伤组织全部褐变。在欧洲栗的培养中,用幼年型的材料培养时含醌类物质少,而用成年型材料培养时含醌类物质多,后者比前者褐变严重。用油棕的幼嫩外植体(如胚)培养较少出现褐变,而用高度分化的叶片接种后则容易褐变。1.3培养基成分及培养条件从长期继代培养且次生代谢物含量高的硬紫草细胞系分离原生质体时,产生大量的紫草素和酚类物质并引起培养物的褐变。用B5培养基配制酶液酶解时,可有效地防止原生质体酶解中出现褐变。在培养茼蒿细胞时,用甘露醇或蔗糖作为渗透压调节剂易发生褐变,不能或只能形成少量细胞团,而用葡萄糖作渗透压调节剂时褐变较少、效果较好。激素使用不当,也会使组培材料褐变。在柿树的组织培养中,选择适宜的培养基类型(改良MS培养基),配合适当的激素种类和浓度(ZT9.13μmol/L、INA0.57μmol/L),能促进外植体的生长与分化,减轻外植体的褐变程度。细胞分裂素BA或KIN有刺激PPO活性提高的作用,使甘蔗在组织培养中易产生褐变。在荔枝组织培养过程中,培养基添加1mg/LBA+0.5mg/L2,4-D时,愈伤组织较硬、增殖缓慢、易褐变;而培养基添加1mg/LBA+1mg/L2,4-D时,愈伤组织浅黄疏松、增殖快。培养基的pH值会影响材料的褐变程度。在进行大白菜叶肉原生质体的培养中发现,褐变程度高的培养基的pH值下降到5.0时,若提高外加的新鲜培养基的pH值至6.5,很大程度上可抑制褐变。在水稻体细胞培养中,pH值为4.5~5.0时MS液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态,其表面呈黄白色,而pH值为5.5~6.0时,愈伤组织严重褐变。培养条件不适宜,如温度过高或光照过强,均可使PPO的活性提高,从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO2也会促进褐变,其原因是环境中的CO2向细胞内扩散,使细胞内CO32+增多,CO32+与细胞膜上的Ca2+结合,使有效Ca2+减少,导致内膜系统瓦解,酚类物质与PPO相互接触,产生褐变。2底物及其衍生物褐变包括酶促褐变和非酶促褐变,目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促引起的。酶促褐变必须具有酶、底物和氧3个条件。引起褐变的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等,但最主要的是PPO。PPO可分为两大类,即漆酶和儿茶酚酶。习惯上,常把儿茶酚氧化酶称为酚氧化酶、PPO、酪氨酸酶、儿茶酚酶或甲酚酶,它与漆酶有明显的区别。漆酶的催化底物范围很广,可以催化单酚、三酚、邻和对位二酚以及芳香族某些氨基酸。儿茶酚氧化酶是一种含铜酶,可以催化两种不同的反应,即催化含一个羟基的酚形成二醌和催化邻苯二酚形成二醌。漆酶可催化对苯二酚或苯酚形成对苯醌或邻苯醌,还可以催化其他多种基质的氧化,如抗坏血酸、对苯二酚等。引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物,按其组成可分成3类:第一类是苯基羧酸,包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等;第二类是苯丙烷衍生物,包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等;第三类是黄烷衍生物,包括花青素、黄酮、芸香苷等。王泽农等把酚类及其衍生物分为六大类:黄烷醇类、4-羟基黄烷醇类(花白素类)、花色苷类(花青素类)、黄酮醇类、黄酮类及酚酸类。其合成途径有两种:一是由苯丙氨酸脱氨基而形成,此途径被认为是高等植物中最主要的途径,PAC(苯丙氨酸氨裂解酶)是催化该反应的关键酶,苯丙氨酸脱氨基后转变成肉桂酸,后者经羟化酶转化为香豆酸,香豆酸由PPO催化加上两个羟基转变为咖啡酸;二是经莽草酸途径形成查耳酮后,再经一系列不同反应生成黄酮、双查耳酮、异黄酮、花青素、黄酮醇、儿茶素等。但并非所有的酚类物质都是PPO的底物。谭兴杰等从荔枝果皮中得到6种酚类化合物,其中只有1种对荔枝果皮PPO有活性,测定其紫外吸收光谱,发现荔枝果皮PPO的天然底物与邻苯二酚的紫外吸收光谱相似。程建军等分析了苹果梨和鸭梨中4种底物与PPO的结合力,结果发现其结合力的强弱顺序为:没食子酸>儿茶酚>绿原酸>咖啡酸。而吴耕西从鸭梨中提取的酶促褐变主要底物经纸层析、紫外扫描、红外光谱鉴定,该底物为绿原酸。茶树中的多酚类则以黄烷醇类为主,约占80%,其中儿茶素及儿茶素没食子酸酯是PPO的适宜底物,而酚酸类包括没食子酸、绿原酸、咖啡酸、鸡纳酸等则含量要少得多。在正常发育的植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变,这是因为在正常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液胞内,而PPO则分布在各种质体或细胞质内,这种区域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结构发生变化和破坏时,则为酶创造了与PPO接触的条件,在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌,进行一系列的脱水、聚合反应,最后形成黑褐色物质,从而引起褐变。晏本菊等研究了苍溪梨、金花梨外植体PPO活性、总酚含量和组培褐变率的变化规律及其关系表明:PPO活性、总酚含量与组培褐变率都存在一定的关系,其组培褐变率的高低取决于PPO活性和总酚含量两种因素。3聚合反应的抑制从理论上讲,酶促褐变可以通过以下3种方法加以抑制:一是除去引起氧化的物质——氧;二是捕捉或减少聚合反应的中间物;三是抑制有关的酶。我们建议采取如下措施:3.1选择合适的外植体选择适当的外植体是克服褐变的重要手段。不同时期、不同年龄的外植体在培养中褐变的程度不同,成年植株比实生幼苗褐变的程度严重,夏季材料比冬季及早春和秋季的材料褐变的程度强。而冬季的芽进入深休眠状态,不太容易生长,所以最好选用早春和秋季的材料作为外植体。取材时还应注意外植体的基因型及部位,选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。3.2在培养基中的消毒处理对较易褐变的外植体材料进行预处理可以减轻醌类物质的毒害作用。其处理方法是:外植体经流水冲洗后,放在2~5℃的低温下处理12~24小时,再用升汞或70%酒精消毒,然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5~7天,使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用0.1%漂白粉溶液浸泡10分钟,再接种到合适的培养基中,如果仍有酚类物质渗出,3~5天后再转移培养基2~3次,当外植体的切口愈合后,酚类物质减少,这样可使外植体褐变减轻。3.3外植体的护理培养基的选择要适宜,注意培养基的状态、类型。培养基的组成如无机盐、蔗糖浓度、激素水平与组合等也要适宜。初期培养可在黑暗或弱光下进行,因为光照会提高PPO的活性,促进多酚类物质的氧化,因此外植体在黑暗中培养可防止褐变的发生。另外,还要注意培养温度不能过高。3.4lh的抗褐变作用褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO的抑制剂。关于用抑制剂来防止褐变的报道有很多,刘曼西等研究了有机酸对马铃薯PPO活性的影响发现,有机酸有抑制PPO活性的作用,还原剂如抗坏血酸、半胱氨酸等也有较强的抑制作用,一定浓度的柠檬酸、苹果酸和α-酮戊二酸均能显著增强还原剂的抑制作用。黄浩等认为水解乳蛋白(LH)的抗褐变机制与两方面的因素有关:一是弱酸性物质可与酚类的羟基作用形成酯类,从而减少PPO作用底物的含量;二是LH竞争性地与底物结合。在水稻细胞的培养基中添加植酸(PA)可防止褐变,PA分子中众多的羟基所产生的抗氧化作用使生色物质的含量下降或PA与PPO分子中的Cu2+络合,从而降低了其活力。添加SO2和亚硫酸盐可抑制许多酶,包括PPO、脂肪氧化酶、抗坏血酸氧化酶等。亚硫酸盐可以直接抑制酶,它与反应的中间体相互作用,阻止中间体参与反应形成褐色色素,或者作为还原剂促进醌向酚的转变,同时还通过与羧基中间体反应,从而抑制了非酶促褐变。此外,硫脲、二氨基二硫代甲酸钠、2-巯基苯并噻唑、氯化钠等也是PPO的抑制剂。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂,在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂,可用于防止褐变。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂,