五灵胶囊抗慢性肝损伤的实验研究

五灵胶囊抗慢性肝损伤的实验研究

五灵胶囊是一种中药复方制剂。它对慢性肝炎的治疗有效，疗效好得多。为了探讨五灵胶囊治疗慢性肝炎的作用机制,为临床用药提供药理学依据。本实验采用在体、离体肝损伤模型,研究五灵胶囊对肝损伤及对肝细胞的修复和保护作用。1材料和方法1.1药物、试剂与仪器动物:昆明小鼠,♂,体重(18±2)g;SD大鼠,♂,体重(250±10)g,[由第四军医大学动物中心提供,动物合格证号:医动证字SC×K(军)2002-05]。试剂:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH-L)、胆碱酯酶(CHE);试剂盒:(购于北京中生北控生物科技股份有限公司);单胺氧化酶(MAO)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽-S转移酶(GSH-ST)试剂盒(购于南京建成生物工程研究所);四氯化碳(CCl4):(AR,批号20001018);DMEM/F12培养基:(USA.Gibco公司产品,批号1095578);胎牛血清(FBS):(杭州四季青,批号0206112,用前56℃灭活,30min)。药物:五灵胶囊(西京医院制剂室,批号20020207)。五灵丸(博爱制药有限公司,批号20020312),D-氨基半乳糖(D-GlaN)(重庆医科大学,批号97-7-28),脂多糖(LPS),(USA.Sigma公司,批号69H4046);仪器:BB16/贺利氏气体培养箱(德国Heraeus公司),MD-100全自动生化仪(USA.CCA)。1.2对五灵胶囊的考察昆明小鼠60只,♂,体重(18±2)g,随机分成6组,即正常组、模型组、五灵胶囊3个剂量组和五灵丸组,每组10只。正常组ip生理氯化钠溶液10ml·kg-1,其余各组均ipD-氨基半乳糖0.3g·kg-1,隔2d注射1次。造模10d后开始给药。正常组与模型组ig生理氯化钠溶液10ml·kg-1,阳性对照组ig五灵丸9g·kg-1(相当于生药10.08g·kg-1),五灵胶囊3个剂量组分别ig五灵胶囊4g·kg-1(相当于生药14.96g·kg-1)、2g·kg-1(相当于生药7.48g·kg-1)、1g·kg-1(相当于生药3.74g·kg-1)。各组给药期间仍ipD-氨基半乳糖,隔2d注射1次(正常组ip生理氯化钠溶液)连续给药11d后,禁食自由饮水,次日给药2h后,小鼠眼眶取血,3000r/min,离心15min,取血清测定ALT、CHE;另取肝脏0.5g,加TMS缓冲液制成10%肝匀浆(4℃)10000r/min,离心20min,取上清液测定ALT、CHE。昆明小鼠60只,♂,体重(18±2)g,分组同上,正常组sc生理氯化钠溶液2ml·kg-1,其余各组均sc20%CCl4-香油溶液2ml·kg-1,隔3d注射1次。造模9d后开始给药。正常组与模型组ig生理氯化钠溶液10ml·kg-1,阳性对照组ig五灵丸9g·kg-1(相当于生药10.08g·kg-1),五灵胶囊3剂量组分别ig五灵胶囊4、2、1g·kg-1。各组给药期间仍sc20%CCl4-香油溶液,隔3d注射1次(正常组sc生理氯化钠溶液)。连续给药10d后,禁食自由饮水,次日给药2h后,小鼠眼眶取血,3000r/min,离心15min,取血清测定ALT、CHE。另取肝脏0.5g,加TMS缓冲液制成10%肝匀浆,4℃、10000r/min,离心20min,取上清液测定ALT、CHE。1.3肝组织病理学检查取经福尔马林中性缓冲液固定的肝组织标本,石蜡包埋。切片厚5μm,作HE染色,光镜下检查。1.4实验分组及药物作用试验取12周龄大鼠,♂,ip25%乌拉坦2ml麻醉,按文献操作制备原代肝细胞,肝细胞重悬于20%FBS-DMEM/F12培养液中,调整细胞密度为2×105个细胞·ml-1,接种于24孔培养板内,置37℃,5%CO2温箱内培养48h后,吸弃培养液,分组:空白对照组:每孔加10%FBS-DMEM/F12;D-GlaN、LPS损伤组加含0.5mmol·L-1D-GlaN、20μg·L-1LPS的l0%FBS-DMEM/F12培养液;五灵胶囊3组:五灵胶囊4、3、2mg·ml-1的l0%FBS-DMEM/F12培养液(以药粉计)。(1)肝细胞的修复作用试验:肝细胞置24孔板内培养48h,空白对照组每孔加10%FBS-DMEM/F12、余下各试验组分别加入含有0.5mmol·L-1D-GlaN、20μg·L-1LPS的l0%FBS-DMEM/F12培养液各1ml/孔,培养24h,终止培养,吸弃上清液,全部试验组经无血清DMEN培养液漂洗1次。空白对照组加10%FBS-DMEM/F12培养液,损伤组各加0.5mmol·L-1D-GlaN、20μg·L-1LPS的l0%FBS-DMEM/F12培养液,各试验药物组分别加试验药物培养液1ml/孔,继续培养24h,取培养上清测定ALT、MAO、LDH-L、GSH-ST、MDA。(2)肝细胞的保护作用试验:上述各组加入各试验药物1ml/孔,37℃,5%CO2孵箱中培养24h,终止培养,吸弃上清液,全部试验组经无血清DMEM培养液漂洗1次。空白对照组加10%FBS-DMEM/F12、损伤组加含有0.5mmol·L-1D-GlaN、20μg·L-1LPS的l0%FBS-DMEM/F12培养液1ml/孔,余下各组加含有0.5mmol·L-1D-GlaN、20μg·L-1LPS的l0%FBS-DMEM/F12培养液1ml/孔,继续培养24h,取上清液测定ALT、MAO、LDH-L、GSH-ST、MDA。2结果2.1对肝匀浆alt的影响肝匀浆ALTCHE的影响模型组与正常组比较血清ALT明显升高(P<0.01)。模型组小鼠血清CHE明显降低于正常组(P<0.01)。五灵胶囊组血清中ALT显著下降(P<0.01)。五灵胶囊组降低ALT的作用强于五灵丸。五灵胶囊大剂量、中剂量组能显著升高血清CHE,与模型组比较差异显著,且有明显剂量依赖关系。其中,大剂量组升高CHE作用强于五灵丸组(P<0.01),五灵胶囊小剂量组无效(P>0.05)。模型组肝匀浆ALT明显低于正常组(P<0.01)。五灵胶囊大剂量对肝匀浆ALT无明显升高作用;中、小剂量及五灵丸可使肝匀浆中ALT显著升高(P<0.05)。见表1。2.2对小鼠血清中alt和che的影响肝匀浆ALTCHE的影响模型组小鼠血清和肝匀浆ALT明显升高,高于正常组(P<0.01)。五灵胶囊3组和五灵丸组小鼠血清中ALT低于模型组(P<0.01);五灵胶囊3组降ALT作用强于五灵丸且无剂量依赖性。模型组小鼠血清和肝匀浆CHE明显低于正常组(P<0.01)。五灵胶囊大剂量组降肝匀浆ALT无明显作用,中、小剂量降肝匀浆ALT作用显著,五灵胶囊3组和五灵丸组小鼠血清和肝匀浆CHE均明显升高,与模型组差异显著(P<0.01),见表2。2.3肝治疗肝病理组织病理结果正常组见图1(A):肝细胞呈放射状排列,胞浆丰富,嗜酸性染色,核圆形,核仁清晰。窦内皮细胞分布规则,可见枯否氏细胞。汇管区伴有少量的淋巴细胞、浆细胞。模型组(D-GlaN损伤)见图1(B):肝细胞肿胀或缩小,肝窦排列紊乱,挤压变窄。有部分肝小叶坏死,呈点状与灶状,肝细胞内有脂褐素和污绿色的胆色素沉积。肝小叶周边肝细胞气球样变周围有少量的淋巴细胞浸润。窦腔与肝细胞索间成纤维细胞增多,内皮细胞激活,枯否氏细胞肥大。五灵胶囊组见图1(C):光镜下观察,部分肝细胞浊肿,肝小叶排列较齐,未见明显的窦腔狭窄。中央静脉周围少数细胞胞浆疏松,呈颗粒或丝状,核染色略淡。肝细胞的再生明显,新生肝细胞的细胞核体积增大,染色质增多而着色深,核仁明显,双核居多。未见碎性肝小叶性坏死,汇管区内也未见炎细胞浸润。模型组(CCl4损伤)见图2(A):肝细胞气球样变,核固缩或溃破,肝索排列紊乱,中央静脉周围有大量坏死的肝细胞,并伴有中性粒细胞、单核细胞等炎细胞浸润。枯否氏细胞增生肥大,窦内皮细胞激活,成纤维细胞增多,胶原大量增生,形成假小叶。五灵胶囊组见图2(B):肝小叶结构大致正常,肝细胞变性程度减轻,在中央静脉与大的汇管区有少量胶原纤维,但无纤维隔形成。五灵丸组:肝细胞浊肿多于五灵胶囊组,窦腔狭窄,可见嗜酸性小体。肝细胞致密,染成粉红色,核仁淡染或消失,呈蜡染者居多,有的肝细胞呈轻微的气球样变,累及5-8个细胞区域。2.4不同剂量对alt、mao、ldh-l、gsh-st、mda水平的影响大鼠原代肝细胞在含0.5mmol·L-1D-GlaN培养液中培养24h,培养上清中ALT、MAO、LDH-L、GSH-ST、MDA,均显著高于对照组数倍(P<0.01),肝细胞严重受损,受损的肝细胞加入不同剂量药液培养24h,其培养上清中ALT、MAO、LDH-L、GSH-ST、MDA水平显著降低,与D-GlaN比较,有显著性差异(P<0.05～0.01)且降ALT,MAO呈明显的剂量依赖关系。大鼠原代肝细胞与LPS培养,上清中酶谱结果与D-GlaN相似,反映肝细胞严重损伤,五灵胶囊能使受损肝细胞升高的酶谱水平下降,显著低于LPS组(P<0.05～0.01),五灵胶囊2mg·ml-1组无降LDH-L、GSH-ST作用,见表3、4。2.5灵胶囊对小鼠肝脏损伤的保护作用不同剂量的五灵胶囊与肝细胞培养24h后,弃除培养上清,分别加入0.5mmol·L-1D-GlaN、20μg·L-1LPS再培养24h,五灵胶囊大、中剂量对2种毒剂均有保护作用,2mg作用不明显。且有一定量效关系,能有效的对抗2种毒剂导致的肝细胞损伤。见表5、6。3灵胶囊对d-glan的诱导体内实验表明五灵胶囊对CCl4肝损伤可显著地降低血清与肝组织ALT,升高由肝损伤时降贮存功能酶CHE,有效地对抗CCl4在体内产生三氯甲基所导致的脂质过氧化使肝细胞坏死,肝功能衰竭,组织学证实:五灵胶囊可使CCl4慢损伤小鼠肝小叶结构大致正常,其治疗小鼠肝细胞变性减轻及坏死面积的改变与炎细胞浸润等病理特征与CCl4损伤组有显著差异。显示有明显修复作用。D-GlaN作用于肝脏后,可导致肝质膜受损,鞘磷脂含量及5-核苷酸酶活性降低,膜蛋白合成减少,造成肝细变性坏死。五灵胶囊可使D-GlaN导致的小鼠血清与肝组织内升高ALT明显地降低,CHE活性显著升高,组织学也证实对D-GlaN诱导小鼠肝细胞变性减轻,坏死面积的改变、炎细胞浸润等病理特征,呈现良好修复和保护作用。原代培养正常肝细胞受D-GlaN作用后,胞膜通透性增高,各种酶逸出进入培养上清。五灵胶囊可使损伤原代肝细胞培养上清ALT、MAO、LDH-L、GSH-ST、MDA水平显著降低,修复受损的肝细胞有量效关系。结果提示五灵胶囊治疗慢性肝损伤与保护肝质膜、增加肝细胞膜的稳定性、促进肝细胞内蛋白合成,有效地防止膜的脂质氧化作用有关。LPS激活单核细胞-巨噬细胞系统,释放多种细胞因子如TNF-а、IL-1、IL-6、NO介导肝细胞损伤,五灵胶囊对LPS诱导原代肝细胞损伤有很好的修复作用,使LPS导致上升的ALT、MAO、LDH-L、G