紫杉醇与人血清白蛋白的毛细管区带电泳研究

紫杉醇与人血清白蛋白的毛细管区带电泳研究

药物与蛋白质的结合研究对药物动力学和疗效研究起到了非常重要的领导作用。紫杉醇被誉为20世纪90年代抗肿瘤药三大成就之一,对铂耐药的卵巢癌疗效较好。作为应用于临床的新型药物,它既是妇科卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌的一线用药,也是肿瘤晚期仍行之有效的化疗药物,因此研究紫杉醇与人血清蛋白的结合作用机制具有很重要的意义。已报道的研究紫杉醇和HSA相互结合的方法有可见分光光度法,荧光法、抗原沉淀法,傅立叶红外光谱、凝胶电泳等,但这几种方法都不同程度的存在耗样量较大,成本高,操作复杂等缺点。本文用毛细管区带电泳(CZE)研究了紫杉醇与人血清蛋白结合的相互作用,得到的结合常数和文献报道的相一致。1实验部分1.1仪器、仪器和仪器P/ACEsystem5000毛细管电泳仪(美国Beckman公司),内设恒温系统和紫外检测器,未涂层熔硅弹性石英毛细管柱47cm×50μmi.d.,有效长度40cm(河北永年光纤厂);TDA-8002型恒温水浴箱(河北黄骅市航天仪器厂);TU-1901型紫外分光光度计(北京Purkinje仪器总厂);970CRT荧光分光光度计(上海分析仪器总厂);ALC-210.4型电子天平;PHS-3C型pH计(上海雷磁仪器厂)。数据采集和图谱处理由仪器自带的软件P/ACEstationversion1.21完成。1.2紫杉醇贮备液紫杉醇(Paclitaxel)(纯度97%～99%,中国药品生物制品检定所);人血清蛋白(HSA)(SigmaNO.37820美国);K2HPO4,KH2PO4,NaCl和无水乙醇均为分析纯;水为二次蒸馏水。紫杉醇贮备液用无水乙醇配制,浓度为1.0mg/mL;人血清蛋白储备液用磷酸盐缓冲液定容至83μmol/L。贮备液均保存于4℃冰箱,实验时根据需要逐级稀释。1.3实验操作1.3.1反应时间和背景缓冲溶液冲洗按要求配制实验所需各种缓冲溶液,用0.45μm的微孔滤膜过滤,并经超声脱气处理。进样前毛细管分别用0.10mol/LHCl溶液,水,0.10mol/LNaOH溶液和水各冲洗2.0min,再用背景缓冲溶液冲洗2.0min。分离模式为毛细管区带电泳,缓冲溶液为50mmol/L硼砂-碳酸钠(pH=10),进样方式为气动进样,压力(0.50psi),进样5.0s,分离电压21kV,紫外检测波长为214nm,毛细管柱温为20℃。1.3.2mol/l模型用磷酸盐缓冲液分别稀释紫杉醇和人血清蛋白标准液至1.0μmol/L。蛋白液和紫杉醇以不同比例混合用磷酸盐缓冲液定容于1.0mL的微量器中,放入恒温箱中温度分别控制在298和310K,在上述电泳条件下测定紫杉醇的游离浓度。2结果与讨论2.1实验条件的优化2.1.1不同缓冲液的分离固定样品浓度和电压(17kV),缓冲溶液浓度为50mmol/L,进样时间10s,分别考察了7种缓冲体系下的样品峰高。实验表明通常使用的Tris-HCl(pH9.0),NaH2PO4-Na2HPO4(pH7.0)和Na2B4O7-HCl(pH8.5)3种缓冲液无法分离检测,NaH2PO4-Na2B4O7(pH8.0),NaHCO3-Na2B4O7(pH9.0),NaHCO3-Na2CO3(pH10.0),Na2B4O7-Na2CO3(pH9.2)4种缓冲液虽然可以分离但是前3种信号较低,且峰展宽,故选Na2B4O7-Na2CO3(pH9.2)为运行缓冲液。2.1.2溶液对峰高的影响固定pH为9.2,电压17kV,进样时间10s,考察不同浓度缓冲溶液对峰高的影响。结果表明:随着缓冲溶液浓度的增加,样品峰高随之逐渐增高,但缓冲溶液浓度过大会导致电流过高焦耳热也急剧增大,峰高随之降低,迁移时间增大,不利于分离测定。于是选50mmol/L为最佳缓冲溶液浓度。2.1.3进样时间和进样时间固定样品浓度和电压(17kV),缓冲溶液浓度50mmol/L,进样时间10s。以碳酸钠-硼砂缓冲体系测定不同pH条件下样品的峰高,实验表明pH增加时信号增加,但是当pH>10时基线不稳且有拖尾现象,因此应选pH10为最佳背景缓冲溶液pH。2.1.4分离电压对峰高的影响固定pH为10,缓冲溶液浓度50mmol/L,进样时间10s,考察分离电压对峰高的影响。实验表明:随着分离电压的增加,样品峰高随之增高,但电压过大也会导致电流过高,使峰高随之降低,而迁移时间是随电压的升高逐渐减小的,综合考虑峰高和迁移时间,选择分离电压为21kV。2.1.5进样时间的选择由于电动进样的歧视效应会导致分离度较差,所以选择气动进样。结果表明,进样时间较短时,峰高和进样时间基本呈线性,但信号太小,灵敏度低,而进样时间过长,样品塞的增长导致峰展宽,峰高降低,迁移时间提前,分离度变差,于是选进样时间为5.0s,既能保证灵敏度的要求,又能获得良好的分离效果。pH10,50mmol/L硼砂-碳酸钠为缓冲溶液,运行电压21kV,进样时间5.0s,紫杉醇与HSA达到结合平衡后的毛细管电泳图如图1。2.2紫杉醇标准液的制备分别准确配制5.1×10-7、1.3×10-6、5.1×10-6、1.3×10-5、5.1×10-5、1.3×10-4g/mL的紫杉醇标准液且在上述优化的条件下分离检测。以峰面积对质量浓度绘制标准曲线,在1.3×10-6～5.1×10-5g/mL间线性良好,线性方程为Y=2123+3.025ρ(10-6g/mL)(r=0.9949,n=5)。2.3多酚结合反应2.3.1结合反应平衡时间对紫杉醇和人血清蛋白结合反应在298和310K的条件下考察结合反应平衡时间。实验结果表明结合反应在两种不同温度下40min均达到平衡,增加反应时间峰高无显著变化。2.3.2药物与hsa的相互作用分别取5只1mL微量器,先加入100μL1μmol/L的HSA,然后分别加入同浓度的紫杉醇20、50、100、150、200、250μL,用磷酸盐缓冲液定容后摇匀,分别先后放在298和310K的恒温水浴箱,放置40min,使其达到平衡。由于毛细管电泳可以分离蛋白质,所以样品无需前处理,可直接进样。药物与血清蛋白之间存在非共价作用力,一般采用位点结合模型,即Scatchard方程式:ν=[Pt]−[P][At]ν[P]=nK−νKν=[Ρt]-[Ρ][At]ν[Ρ]=nΚ-νΚ式中[Pt]和[At]分别表示为体系中药物和人血清蛋白的总浓度,[P]表示游离药物的浓度,ν表示平均结合数,n表示结合位点数,K表示结合常数。固定HSA的浓度[At],改变药物分子总浓度[Pt],求不同药物分子总浓度时的ν值,表1列出了该实验中利用毛细管区带电泳和紫外检测相结合测得的不同摩尔比的药物与HSA的相互作用数据。以ν[P]ν[Ρ]对ν作图可得一直线如如图2所示。310K时:ν[P]=−3.226V+10.14(R=0.9911,N=6)ν[Ρ]=-3.226V+10.14(R=0.9911,Ν=6);298K时:ν[P]=−1.606V+6.928(R=0.9926‚N=6)ν[Ρ]=-1.606V+6.928(R=0.9926‚Ν=6)。根据Scatchard方程式,可以得到K=3.4×104L/mol,n=3.0(310K)和K=1.7×104L/mol,n=4.1(298K)。由不同温度下的平衡常数根据热力学公式可得ΔG、ΔH和ΔS分别为-27kJ,45kJ/mol,233J·mol-1·K-1(310K)及-24kJ,45kJ/mol,233J·mol-1·K-1(298K),表明其作用过程是一个熵增加,吉布斯自由能降低的自发分子作用过程。2.3.3混合溶液的吸收光谱测量固定人血清蛋白溶液浓度不变,不断增加紫杉醇的浓度,以紫杉醇空白液为参比,测量混合溶液的吸收光谱。以吸光度A为纵坐标,绘制吸收曲线。可以看出,随着紫杉醇浓度的增加,紫杉醇各吸收带均有规律的增大,但是并没有出现一等吸收带,这表明紫杉醇与人血清蛋白之间存在着范德华力结合特征,见图3。2.3.4紫杉醇浓度对hsa表达的影响利用荧光分光光度计可测得紫杉醇-HSA体系的荧光发射光谱图,可以看出随着紫杉醇浓度的增加,HSA的内源荧光强度有规律的降低。这也说明两者之间存在着相互作用,并对HSA的内源荧光起静态熄灭作用(见图4)