连钱草总黄酮提取条件优化

连钱草总黄酮提取条件优化

连草是嘴唇科植物的活血丹glechoma（nakai）kubre，干燥的土壤。具有润水、通粘液、清热解毒、祛瘀、消肿等功效。临床上用于治疗热淋、石淋、湿热黄疸等疾病。连钱草茎叶含挥发油,主要含单萜烯类成分,还含有熊果酸、棕榈酸、琥珀酸、咖啡酸、阿魏酸等。对其非挥发性成分研究很少。在我国连钱草资源十分丰富,几乎分布于全国各省,具有极大的开发价值。目前也有超声和加热回流提取连钱草中总黄酮的报道,但未将超声、加热、循环同时应用于提取过程。本研究采用超声循环技术对连钱草中总黄酮进行提取,确定影响效果的主要因素和超声提取黄酮的优化工艺条件,为有效的提取连钱草中的总黄酮开辟了新途径。1药品、化学品试剂721紫外分光光度计(山东高密分析仪器厂),“弘祥隆”HF-2.0B超声循环提取机(北京弘祥隆生物技术开发有限公司),旋转蒸发器RE-52(上海精宏实验设备有限公司),LD4-2A型低速离心机(北京医用离心机厂),TD系列电子天平(天津市天平电子仪器有限公司)。连钱草(安徽亳州药材公司,由辽宁中医药大学生药学贾天柱教授鉴定)粉碎,过80目筛;芦丁对照品(中国药品生物制品检定所,批号0080-9705)。乙醇(AR,天津市北方天医化学试剂厂),亚硝酸钠(AR,天津市泰兴试剂厂),硝酸铝(AR,天津市泰兴试剂厂),氢氧化钠(AR,天津市标准科技有限公司)。2方法和结果2.1对照品溶液的制备精密称取120℃常压干燥至恒重的芦丁对照品25.0mg,置于100mL的量瓶中,加60%乙醇约60mL,密塞,超声使其溶解,放冷,加60%乙醇至刻度,摇匀,得芦丁对照品溶液(0.25mg·mL-1)。2.2亚硝酸钠溶液精密量取芦丁对照品溶液0,1,2,3,4,5mL,分别置于25mL的量瓶中,分别加水5,4,3,2,1,0mL,加5%亚硝酸钠溶液1mL,摇匀,放置6min,加10%三氯化铝试液1mL。摇匀,放置6min,再加5%的氢氧化钠溶液10mL,加水至刻度,摇匀,放置15min后以第1管作空白对照,在510nm测定吸光度,以吸光度值对芦丁对照品含量绘制标准曲线,回归方程Y=6.7371X-0.0001,线性范围0.01~0.05mg·mL-1,r=0.9999。2.3重复试验取5份供试品溶液0.1mL,按标准曲线绘制项下的方法测定总黄酮含量,结果RSD为0.9%。2.4测定一次吸光度取供试品溶液0.1mL,按标准曲线项下方法操作,并每隔5min测定一次吸光度。结果表明,20min以内测定吸光度RSD<2%,建议定容后立即测定。2.5加样回收试验取供试品溶液5份,分别加入芦丁对照品溶液适量,按标准曲线绘制项下的方法测定总黄酮含量,平均回收率101.38%,RSD1.13%,结果表明加样回收良好。2.6总黄酮含量的测定吸取1mL供试品溶液,然后按标准曲线制备项下方法测定吸光度值,带入芦丁标准曲线方程得出质量浓度,然后计算各提取液中总黄酮的含量(以芦丁计),即为得率。公式如下:总黄酮(%)=CV1V21000WV3×100%(%)=CV1V21000WV3×100%C:测定液黄酮质量浓度(mg·mL-1);W:药品量(g);V1:提取定容体积(mL);V2:显色反应定容体积(mL);V3:显色反应取样液体积(mL)。2.7连钱草总黄酮含量的测定按照黄齐慧等在不同采收期对连钱草中总黄酮的影响中采用的提取方法:精密称取60℃干燥至恒重的样品粗粉1.0g,置玻璃烧瓶中,加入60%乙醇100mL,水浴加热回流提取60min,提取2次,过滤,合并滤液,放置24h后,过滤,减压回收乙醇,加蒸馏水定容至100mL,测定吸光度,计算总黄酮质量分数为5.168%。按照祝德秋等在连钱草中总黄酮的含量测定中采用的提取方法:取连钱草粉末约0.5g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加60%乙醇60mL,密塞,称定重量,超声50min。放冷,密塞,再称定重量,用60%乙醇补足减失的重量,摇匀,过滤,测定吸光度,计算总黄酮质量分数为4.027%。2.8单因素分析2.8.1提取总黄酮含量分别按照固液比1∶100;1∶50;1∶10加入相应的连钱草和60%乙醇,在400W,1000r·min-1,室温下进行超声循环提取20min,测定黄酮吸光度,并算出含量。结果总黄酮质量分数依次为4.425%,3.470%,3.207%。从实验结果可以得出,固液比为1∶100时提取效率最高,因此以下的单因素分析及正交实验均采用固液比为1∶100。2.8.2提取溶剂浓度筛选取连钱草24g,分别用梯度乙醇(95%,80%,60%,40%,20%,0%)2400mL,在400W,1000r·min-1,室温下进行超声循环提取20min,测定黄酮吸光度,并算出含量。结果总黄酮质量分数依次为0.714%,2.644%,3.772%,3.890%,3.594%,2.733%。从实验结果可以得出,从既节省溶剂又高效的角度可以考虑40%乙醇,但是溶剂浓度降低大量水溶性杂质给后续工作带来大量麻烦。60%乙醇中黄酮含量较高,因此选择60%乙醇进行正交实验。2.8.3测定总黄酮含量取连钱草24g,60%乙醇2400mL,在400W,1000r·min-1,室温下进行超声循环提取,每10min取样1次,测定黄酮吸光度,并算出含量。即在超声时间为10,20,30,40,50,60min时,黄酮质量分数依次为2.614%,4.306%,4.380%,4.692%,4.870%,4.900%。从实验可以看出,随着时间的增加黄酮质量分数也在增加,但50min以后增长趋缓,因此选择50min左右进行正交试验。2.8.4超声循环提取总黄酮含量的测定取连钱草24g,60%乙醇2400mL,在400W,1000r·min-1,室温下进行超声循环提取,每次20min,测定黄酮吸光度,并算出含量。提取次数分别为1,2,3,4次时,总黄酮质量分数依次为4.128%,4.634%,4.635%,4.651%。可以看出,随着提取次数的增加黄酮质量分数也随着增加,但是2次以后含量增长缓慢,因此提取2次即可。2.8.5提取温度温度过高乙醇挥发严重,而且杂质溶出增加;温度过低,影响黄酮在乙醇中的溶出。因此,综合考虑,选取20,30,40℃进行正交实验。2.9连钱草中总黄酮最佳提取条件的确定选取超声功率(A)、超声时间(B)、提取温度(C)、溶剂体积分数(D)为主要考察因素,各因素及水平设置如表1所示。正交实验采用4因素3水平正交表,即L9(34)正交表进行实验,见表2。且在正交表安排的每个实验号条件下进行3次重复实验。采用极差法对正交试验结果进行差异分析,由表2可以看出连钱草中总黄酮的最佳提取条件为A3B2C3D2,即超声功率800W,超声时间90(45,45)min,提取温度40℃,溶剂浓度65%。由表2中R值可以看出,4种因素对连钱草中总黄酮提取效果的影响程度依次为:提取温度>溶剂浓度>超声时间>超声功率。该提取工艺最大的影响因素是提取温度,最小的是超声功率。2.10分散分析对表2的试验结果进行方差分析和F检验结果见表3。F检验结果表明,提取温度、溶剂浓度对黄酮提取率都具有显著的影响。2.11黄酮质量分数在最佳提取条件下进行3次重复实验,所提取的总黄酮质量分数平均值为5.228%,大于正交设计中的含量,所得结果正确。且所得总黄酮含量高于2.7传统总黄酮提取方法及含量测定中的结果。3提取温度和溶剂浓度对提取效果的影响本实验在最大吸收波长的选择上,是将芦丁对照品、供试品溶液分别按标准品溶液的制备和标准曲线绘制项下的方法制得后,于波长200~800nm扫描,均可见在510nm处有最大吸收,因此选择510nm作为芦丁和供试液测定的最大吸收波长。结果表明提取温度和溶剂浓度对提取效果有极显著的影响。分析原因认为适度增加温度有利于提高溶剂的溶解度,但温度过