几种致病真菌对酮康唑微囊的体外敏感性研究

几种致病真菌对酮康唑微囊的体外敏感性研究

酮康唑（kcz）是一种广泛的三醇抗真菌药物，对各种致病性微生物（如细菌、细菌和真菌）产生了强烈的抑制作用。它对局部和全身的细菌感染也有很强的抑制作用。常见的不良反应为恶心、呕吐及皮肤搔痒等。其结构中具有酰胺基和醚基等不稳定基团,易氧化变色,而影响其制剂的稳定性和疗效。对于不太稳定的药物,微囊化改造是提高稳定性的有效方法之一。同时,微囊包裹还可减少药物对胃肠道的刺激性,并可使药物具有缓释或控释的特性,不仅利于提高药物的生物利用度,且能为进一步的剂型改造打下基础。通过实验证实,KCZ微囊化改造可行,有简单可靠的质量控制方法,且能显著提高其稳定性。在此基础上,进一步探讨KCZ微囊与其原料在体外抗真菌活性方面的不同。1实验部分1.1菌株筛选和培养基KCZ原料(南京制药二厂,批号:20000603);KCZ微囊(自制,批号:20030305A,含量21.94%);氟康唑片(康锐,江苏扬子江药业集公司,批号:020617,每片50mg)。白色念珠菌、热带念珠菌、高里念珠菌、近平滑念珠菌、平托球拟酵母菌均由成都军区昆明总医院呼吸内科、干部病房呼吸道感染患者痰液标本中分离所得,并选取直接镜检和培养均阳性的菌株,按常规方法、芽管试验、生化性状、真菌显色基等进行了鉴定。沙堡氏琼脂培养基(SabouroudSAgar,杭州天和微生物试剂有限公司)63g,蒸馏水1000ml,121℃15min高压灭菌;霉菌培养基(FludmolasMedium,杭州天和微生物试剂有限公司)16g,蒸馏水1000ml,加热煮沸溶解,151℃30min高压灭菌。TTC沙堡氏培养基(杭州天和微生物试剂有限公司)52g,蒸馏水1000ml,121℃15min高压灭菌。1.2菌株制备及接种1.2.1药敏管制备KCZ用50%乙醇配成200μg·ml-1,超声振荡10min,10级倍比稀释使药基浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.6、0.8、0.4、0.2μg·ml-1;取KCZ微囊用生理盐水配成含KCZ相当于1000μg·ml-1的混悬液,滴加10%HCl调pH3,超声振荡10min,10级倍比稀释使药基浓度为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95μg·ml-1;氟康唑片研碎用灭菌蒸馏水配成含氟康唑1000μg·ml-1,同样倍比稀释至1.95μg·ml-1。以1∶9的药物与培养基之比混合制成含系列药浓度的培养基,分装入试管内,每管5ml封口待用。第11、12管加不含药液的培养基,其中第11管为生长阳性对照管,第12管为空白阴性对照管。1.2.2菌液的制备及接种将受试菌在TTC沙堡氏培养基上连续转种2次,以保证其纯度和活力。取经35℃培养24h的真菌菌落,加入5ml液体培养基中,35℃培养24h,将菌悬液滴入血细胞计数板上,测定25个小方格内的真菌孢子数,乘以10即为每立方毫米菌数,再乘以1000即为每毫升菌数,按此法用生理盐水调节菌数达1×105CFU·ml-1。冰箱冷藏备用。将待检菌按念珠菌1×105CFU·ml-1菌量用微量加样器从第11管至第1管的顺序加入各药敏管中,第12管不加。1.2.3培养及结果判定接种后的药敏管分别置37℃孵育16h(热带念珠菌),26℃孵育24h(酵母菌),35℃孵育24h(其他念珠菌)。结果判定(确定MIC值):首先观察阳性对照管内底部出现明显白色沉淀,表示真菌在该条件下生长良好;接着确定阴性对照管内确无沉淀,表示无任何微生物污染;再从高至低浓度药液管逐个检查真菌被抑制生长的情况,以阳性对照管生长被抑制达80%以上的管为其MIC终点浓度。1.3菌株制备及接种1.3.1药敏板的制备KCZ用50%乙醇配成100μg·ml-1,超声振荡10min,10级倍比稀释至0.2μg·ml-1;取KCZ微囊用生理盐水配成含KCZ相当于1000μg·ml-1的混悬液滴加10%HCl调pH3,超声振荡10min,10级倍比稀释至1.95μg·ml-1。沙堡氏琼脂培养基趁热(55℃左右)倾入5.5cm平皿内,每皿4.5ml,加入不同浓度的稀释药液0.5ml,将二者充分混合,置桌水平面使成固体,厚度约为2mm。另设培养基的空白阴性对照皿及不含药物但含菌的阳性对照皿。1.3.2菌液制备及接种取经纯化的真菌于液体培养基中35℃24h,摇匀后于血细胞计数板上计数,以生理盐水调节菌数达1×105CFU·ml-1。冰箱冷藏备用。各待检菌液取1μl接种于平皿内,空白对照皿不加。1.3.3培养及结果判定接种后的药敏板分别置37℃孵育16h(热带念珠菌),26℃孵育24h(酵母菌),35℃孵育24h(其他念珠菌)。判定终点,确定MIC严格按上述时间孵育后,将平皿置于良好光线下观察各菌的生长情况,首先确定阳性对照平皿的真菌生长良好,阴性对照平皿无任何污染菌生长,再逐个观察从高浓度至低浓度平皿上的真菌生长情况,菌不生长皿的药物浓度即为该菌的MIC值。2.3药物敏感试验2.3.1试管(液体)稀释法KCZ、KCZ微囊、氟康唑片对临床分离菌株药敏测定的MIC分布见表1～3。2.3.2琼脂稀释法酮康唑原料、酮康唑微囊对临床分离菌株药敏测定的MIC分布情况见表4、5。2kcz微囊细菌耐药和抗菌性能所有菌株均重复3次进行药敏测定,药物3次测定的MIC波动不超过一个药物浓度梯度。经规定时间孵育后,阳性对照的所有菌株生长良好,阴性对照无生长,MIC终点清楚。在试药配制过程中,采用超声振荡,可使药物迅速溶解;KCZ微囊经超声振荡后,其混悬液中颗粒分布均匀,经镜检微囊无破碎。KCZ的MIC与有关文献相近。氟康唑片对常见致病念珠菌的MIC范围与资料(0.8～12.5μg·ml-1)相比有所增大,按美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)提出的念珠菌分界点标准,21株检测细菌中,11株对氟康唑片敏感(52.38%),1株剂量依赖性敏感(4.76%),9株耐药(42.86%),提示目前临床上真菌对氟康唑的耐药性正在增加。KCZ主要外用,其应用范围有限,临床应用时耐药性的产生尚不明显;深部真菌感染主要用氟康唑口服和静滴治疗,用药周期长、剂量大,较易产生抗药性。通过调查,我们发现实验中的10株不敏感实验菌,来自于同一因二重感染而反复发作深部真菌感染症状的患者,其中的1株剂量依赖性受试菌取自该患者第一次治疗末期,而其余9株则取自第二次住院中期,其中2株对伊曲康唑敏感,另外7株对两性霉素敏感。长期、反复用药是造成真菌对氟康唑耐药的原因。KCZ微囊的MIC较原料大许多,实验中如果使