分子诊断学：DNA测序

DNA测序DNAsequencing分子诊断学

1-1定义

*基因：一段DNA序列

*基因的不同，是其碱基组成和排列顺序的不同

*用一定的方法测定并分析靶基因的碱基组成和

排列顺序（即DNA的一级结构）即为DNA测序

1

概述是现代分子生物学中的一项重要技术是进一步研究基因的功能、基因结构与功能关系的基础在临床，为疾病的分子诊断提供最精确的判定依据

是分子诊断的黄金标准，其权威性高于其他DNA分析方法（SSCP,RFLP,基因芯片，杂交等）

1-2

DNA测序的意义1-3前景在过去的30年中，作为最重要的生物医学研究手段之一，

该技术不断发展，其数据产出能力呈指数增长在刚出现的技术中，可实现“1000美元基因组”将来可望实现“100美元基因组”201312《自然》杂志

从一块40万年前的人类大腿骨上提取的

线粒体DNA

被测序本讲内容1DNA测序概述2第一代测序技术（G1）

1）G1之Sanger法及其自动化（1）G1.10Sanger法（手工测序，1977）（2）G1.11(自动：PAGE）（3）G1.12(自动：HPCE)

2）G1.2化学法（1977）和G1.3杂交测序法

--略

3）G1.4焦磷酸法(1987)3测序策略4G25G36G47基因组测序成果2DNA测序的方法

2-1第一代测序技术（G1）

1）G1之Sanger法及其自动化

（1）G1.10Sanger法（手工测序，1977）（2）G1.11(自动：PAGE）（3）G1.12(自动：HPCE)

2）G1.2化学法和

G1.3杂交测序--略

3）G1.4焦磷酸法(1987)NyrénP（1）Sanger双脱氧链终止法（要求掌握）（chainterminationmethod，G1.10）

由Sanger于1977年创建全称：双脱氧链末端合成终止法简称：Sanger法，

末端终止法

双脱氧法，

酶法

核苷酸之间如何相连？？？Sanger:成功地测定了胰鸟素的精细结构，因而获得1958年的诺贝尔化学奖；建立该法，获得1980年诺贝尔化学奖5´端3´端

CGAI、测序原理（1）DNA合成

在DNA聚合酶催化下，前一个核苷酸的3’-OH与再接上来的一个核苷酸的5’-P之间形成3’,5

-磷酸二酯键，从而连接形成多核苷酸链（2）链合成的人为终止链终止剂

即双脱氧核苷三磷酸（2’,3’-ddNTP）

什么是ddNTP?终止合成的原理？

在脱氧核糖的3’位置缺少一个OH：

它可在DNA聚合酶作用下通过其5’-P掺入到正在延伸的DNA链中；但，由于缺乏3’-OH，它无法与后续的dNTP形成磷酸二酯键！！

SO，DNA链的延伸便于此嘎然而止！！！（3）试想：如在DNA合成体系中，加入少量ddNTP，会出现什么结果？

竞争参入（4）每个测序反应体系的组成DNA聚合酶单链DNA模板（待测片段）带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物Mg2+原料-dNTPs(dATP,dGTP,dCTP和dTTP)终止剂-ddNTPs(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)

**关键：调整每个测序反应中dNTP与ddNTP的比例(一般是10：1）推测该反应体系的产物！A*聚合酶*模板*测序引物*dNTPs*ddATP*Mg2+TGC思考：该体系与PCR反应体系的异同？I测序反应原理

体系中的ddNTP会与其相应的dNTP之间竞争着参入正在延伸的DNA链中，结果：

两者随机参入链中相应位置

当dNTP参入，则链继续延伸当ddNTP参入，则链延伸终止最后，形成一系列长短不一的多核苷酸链，特点：**起点相同：引物**末尾不同：是各自特异的双脱氧碱基**长度各一：长度由待测序列的碱基顺序决定

I测序反应原理（5）在四组独立的DNA合成体系中,分别产生四组、以各自特异的ddNTP为末端、长短不一的多核苷酸链（6）通过高分辨率的变性PAGE分离它们

前提：可区分彼此只差一个dNTP的单链DNA（7）放射自显影后，从凝胶底部到顶部、按5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列I测序反应原理II、测序体系的关键成分（1）链终止剂

2’，3’-双脱氧核糖核苷酸（ddNTPs)（2）用于测序的变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE)

胶长40cm，厚度均匀

4-8%丙烯酰胺

7mol/L尿素

（3）模板，即待测序的DNA片段&&单链模板

**通常以M13噬菌体为载体，制备之，效果最佳**还可以什么方法获得单链DNA做模板???

&&双链DNA模板：需要先变性（4）引物酶促测序反应中，利用一个与模板特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA合成的引物II、测序体系的关键成分（5）DNA聚合酶*大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段&&是酶法测序最早采用的酶

&&其持续合成能力低，标准测序反应所能够测得的序列长度通常约250-350核苷酸

&&价廉，对已知序列DNA亚克隆的鉴定仍有应用价值*测序酶（Sequenase）

是经改造的T7噬菌体DNA聚合酶，活性非常稳定，具有很强的链延伸能力和极快的聚合反应速度，是测定较长DNA序列的首选酶

测序酶2.0版是测序酶的基因工程产品，很稳定

II、测序体系的关键成分（5）DNA聚合酶

Taq

DNA

聚合酶：适用于测定在37℃时会形成

二级结构的单链DNA

模板序列因为Taq

DNA

聚合酶在70～75℃活性最高，这一温度下即使GC丰富的模板也无法形成二级结构

该酶的持续合成能力甚佳

（6）放射性同位素标记的ddNTP：

α-35S-ddNTP其具有高分辨率和低本底测序反应产物-20℃保存一周也对结果无明显影响

还可标记引物！！！II、测序体系的关键成分

III、测序产物的凝胶电泳及识读能否将测序反应中产生的各种不同长度的DNA片段进行有效分离是序列测定成败的关键变性PAGE可将长度只相差一个核苷酸的2个DNA片段有效地分离

（毛细管电泳和超薄凝胶板电泳技术的应用，大大提高了序列分析的质量和效率，后详）

（1）建立测序反应体系&四管中均有模板、引物、DNA聚合酶和dNTPs&四管的终止剂不同：带标记的

ddA/ddG/ddC/ddT（2）模板与引物退火（杂交）

（3）测序反应：引物的延长与合成阻断同时进行

最后，四管中内的所有产物是

一系列多核苷酸聚合链，其两两间的最小差异是1nt

（4）上样、电泳、放射自显影和序列识读IV、测序过程测序原理—小结

在DNA合成时，利用ddNTP与dNTP竞争掺入到新生的DNA链上，致链延伸反应终止。

在模板指导和测序引物引导下，按碱基配对原则，聚合酶不断将dNTPs加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链如果加入ddNTPs,由于其3’位置上缺少一个OH，故不能与后续的dNTP形成磷酸二酯键。最后，每个反应体系中可合成一系列具有相同的5’端和不同3’端的引物延伸链，是长短不一的核苷酸链混合物各反应体系的系列产物的3’末端分别是其相应的ddNTP通过高分辨率的变性PAGE（可区分一个核苷酸之差）分离和放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列Sanger测序在DNA合成体系中加入同位素标记的链延伸终止剂（ddA，ddT，ddC，ddG）ddNTP的两个作用可以当作正常核苷酸参与新链一旦参入DNA中，其后就不能再连接核苷酸电泳分离谁（哪个泳道）终止，碱基就是谁此方法获1980年的Nobel奖

Sanger双脱氧终止法发明之初，其阅读长度只达到80bp，如今已上千bp

2DNA测序的方法

2-1第一代测序技术（G1）

1）G1之Sanger法及其自动化（1）G1.10Sanger法（手工测序，1977）（2）G1.11(自动：PAGE）（3）G1.12(自动：HPCE)

2）G1.2化学法（1977，略）G1.3杂交测序法（略）

3）G1.4焦磷酸法(1987)NyrénP

2)G1.11(自动化测序，PAGE)

基本原理:与链终止法测序原理相同基于Sanger法的自动测序（Hood，1986年)差别：用不同颜色的荧光标记ddNTPs或引物

如：ddATP-RedddGTP--yellowddCTP-Blue

ddTTP-green

或者：A反应系统引物-R，G反应系统引物-YC反应系统引物-B，T反应系统引物-G

I链终止剂标记法测序用四种不同的荧光染料标记不同的ddNTPs测序反应可以在同一反应管内进行反应产物按终止位置的碱基不同，其3’末端带不同颜色的荧光基团，被激发后产生不同的荧光将反应产物加样于凝胶的同一加样孔进行电泳分离，相邻片段间仅相差一个核苷酸当带有荧光染料的DNA片段泳动到检测仪扫描处（凝胶底部）时，受到激光的激发而产生荧光，不同荧光代表不同碱基，通过检测系统将信号不断传送到计算机，通过软件分析，自动读出待测DNA的全部核苷酸序列DNA带负电，都向正极泳动；DNA在电泳胶中的迁移率与其片段大小有关

测序结果（ABIPrism310Geneticanalyzer）

红色-T

绿色-A

兰色-C

黑色-G

II引物标记法测序（自学）将四种不同的荧光染料分别与引物结合测序反应分别在4个反应管体系中进行（每管含4种dNTPs、1种ddNTP和1种荧光素标记的引物）DNA聚合酶催化合成互补的新链时，由于ddNTP随机终止链延伸反应而形成不同长度的DNA片段，每种ddNTP终止反应的片段带同一种特异的荧光染料在反应结束后，将4个反应管的产物混和在一起，在变性聚丙烯酰胺凝胶的一个泳道中进行电泳其余与“链终止剂标记法”相同II引物标记法测序

相同的引物的5’端由不同颜色的荧光染料标记设4个反应体系，

即特定颜色荧光标记的引物与特定的ddNTP保持对应关系因此，可以合并在一个泳道上样IIIDNA测序自动化特点原理与末端终止法相同标记物为四色荧光染料激光扫描自动读出序列结果清晰、准确，分辨率高测序速度快（200bp/h）

IV

DNA自动测序与手工测序的异同相同点：原理与末端测序法相同不同点：1）标记物不同：手工测序是放射性核素标记而自动测序是4种荧光染料2）加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳3）检测手段不同：手工法采用放射自显影，从4种寡聚核苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑优点：

1）四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间

2）不需干燥凝胶和放射自显影

3）可连续电泳，可读出较长的核苷酸序列

4)可同时测序多个样品缺点：

四个反应产物点在一条道上,相互间会发生干扰,导致读序时分辨率下降自动测序的优缺点胡德（LeroyEdwardHood）实验室（ABI）的四大发明蛋白质测序仪:1977年（ABI)DNA合成仪：1982年（ABI)DNA测序仪：1986-06(ABI)蛋白质合成仪:20世纪80年代（ABI)

ABI发明四大生物研究设备，并成功实现产业化，为分子生物学的发展打下了坚实的技术基础，对世界生命科学研究和产业发展产生了深远的影响。胡德现任CNSI董事、美国纳斯达克上市公司董事，他还是美国国家科学院(NAS)院士、美国学者协会会员、美国科学艺术学院院士。3)G1.12(自动化，HPCE)

（Highperformance

capillaryeletrophoresis)

是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物与PAGE比,其采用高压电场,分离速度快

CE的优点：“三高二少”

高灵敏度：

常用紫外检测器的检测限可达10-13～10-15mol,激光诱导荧光检测器则达10-19～10-21mol

高分辨率：

其每米理论塔板数为几十万；高者可达几百万乃至千万,而HPLC一般为几千到几万高速度：

最快可在60s内完成,在250s内分离10种蛋白质,1.7min分离19种阳离子,3min内分离30种阴离子

样品少：

只需nl(10-9l)级的进样量

成本低：

只需少量(几毫升)流动相和价格低廉的毛细管

3)G1.12(自动化，HPCE)

即：用CE取代PAGE，以高压直流电场为驱动力，使荷电粒子通过毛细管筛分介质，按分子大小进行电泳分离，经过监测器收集序列信息，达到测序目的其使PAGE测序仪8小时的工作在短短15分钟完成！

HGP的提前完成主要得益于该技术的问世

测序速度与质量得到了进一步的提高**平板凝胶被毛细管替代**平板电泳分离技术被

毛细管电泳所取代**取消了手工上样**降低了试剂消耗**提升了分析速度**紧凑的CE设备更易于实现

并行化，获得更高的通量以ABIPRISM310型DNA测序仪了解测序原理

采用HPCE取代传统的PAGE，应用该公司专利的四色荧光标记的ddNTPs，通过单引物进行PCR测序反应生成的PCR产物是两两相差最小是1个核苷酸的单链DNA混合物，其3’末端是带荧光的ddNTP

四种荧光的测序PCR产物的混合物在一只毛细管内电泳，避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高测序的精确度原理（1）

不同大小的DNA分子，在CE中的迁移率不同，当其通过毛细管读数窗口时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupleddevice)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，并在CCD摄影机上同步成像分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的

原理（2）

其结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析是全自动电脑控制的测定DNA片段之碱基顺序和大小的高档精密仪器

临床上，除进行常规DNA测序外，还可进行SNP分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等

具有测序精确度高判读序列长达800～1200bp一次电泳可测定样品96～384个，快速方便

这一代测序仪在HGP测序的后期阶段起到了关键的作用,加速其完成，

而且由于其在原始数据质量以及序列读长方面具有的优势,这些测序仪今天还在使用之中

ABI的DNA测序仪-377310型全自动遗传分析仪（ABI)其它DNA全自动分析仪ABIPrism®3100遗传分析仪

3700型全自动遗传分析仪(ABI)安玛西亚DNA序列分析系统型号MegaBACE500/1000/4000

Sanger法的主要技术流程

1）待测序DNA的制备：分子克隆（随机从头测序）或PCR（靶片段重测序）2）测序反应：

四个体系或一个体系（四色荧光标记ddNTPs），变性、退火、延伸，多次循环，最后得到包含所有长度的末端标记的片段混合物3）测序示踪：PAGE或HPCE，用激光检测各种单链DNA走出凝胶的时间和荧光类型4）计算机分析：软件把示踪信号翻译成序列，并计算出误差概率SangerDNA测序技术经过了30年的不断发展与完善，现已可对1,000bp以上的DNA片段进行测序，而且对每一个碱基的读取准确率高达99.999%，测定费用0.5美元/千碱基，数据通量达60万碱基/天不论这些数字如何令人印象深刻,第一代测序技术在速度和成本方面都已达极限（由于其对电泳分离技术的依赖,使其难以进一步提升分析的速度和提高并行化程度,并且难以通过微型化降低测序成本）因此,需要开发全新的技术来突破这些局限

2-1G1

G1.2之化学法（1977，略）

1977年，在Sanger双脱氧链末端终止法建立的同年，Maxam与Gilbert合创DNA化学测序法该法是以化学修饰为基础，故其简称有：

化学法

Maxam-Gilbert法

M&G法G1.3自动化测序-杂交测序法(略)

结合核酸杂交、基因芯片技术和测序技术将一套长度一定、序列已知、具有全部可能的碱基排列组合的寡核苷酸探针有序地固定于芯片，再与未知序列的待测DNA片段进行分子杂交，然后根据杂交的信息进行分析和组装,拼接出与待测DNA序列互补的序列，从而推知待测DNA的碱基序列(Sequencingbyhybridization,SBH)

利用基因芯片进行杂交测序的原理由杂交位置确定的一组探针序列杂交测序法优缺点杂交测序法不需要采用凝胶电泳，杂交时间短，易于自动化快速化、微型化和自动化杂交测序法不适用于简单重复序列的直接测序，如poly（A）尾及卫星DNA

它把哪些分子生物学技术融在一起了？2）G1.4焦磷酸测序技术(1987)

（PyrosequencingTechnology）Sanger法的优势在于分析未知序列，且单向反应的读序能力较强，适合于要求读序长的工作，如基因组测序有些工作的主要指标不是读序长度，而是读序精确和能说明问题。如，当需要了解已知序列的DNA在某个位点是否有突变、插入或缺失时，常只需测定其中十几～几十bp

对此：Sanger法则非首选而新发展的Pyrosequencing技术则是最适合2）G1.4焦磷酸测序技术(1987)

Pyrophosphoricacid（diphosphoricacid）isproducedfromphosphoricacidbydehydration（脱水）.

Pyrophosphoricacidslowlyhydrolyzes（水解）inthepresenceofwaterintophosphoricacid.

2H3PO4⇌H4P2O7+H2O焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是由Nyren和Ronaghi等人于1987年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术在以靶DNA链为模板指导核酸合成的过程中，将释放的可见光作为检测信号，从而对靶DNA链进行实时测序的方法，是一种合成测序技术无需进行电泳，DNA片段也无需标记，操作极为简便适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与“SangerDNA测序法”相媲美，而速度却大大的提高焦磷酸测序技术原理由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应原理：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶(ATPsulfurytase)、荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的焦磷酸测序技术的反应体系：

待测单链、测序引物、4种酶及反应底物后者包括5’-磷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfat，APS)和荧光素(Luciferin)/video/80-554-1.htmlII焦磷酸测序技术原理同一反应体系中由四种酶催化的级联化学发光反应首先让测序引物与待测模板结合成杂交体在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中，并释放出等摩尔的焦磷酸基团（PPi）PPi最终转化为可检测的光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值

每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比随后，加入下一种dNTP，继续DNA链的合成

四种酶及其催化的级联反应（cascade)

DNA聚合酶

ATP硫酸化酶（ATPsulfurylase）荧光素酶（luciferase）

ATP双磷酸酶（apyrase）血液凝固过程中的酶级联反应凋亡过程中的ｃａｓｐａｓｅ级联反应等II焦磷酸测序技术原理第1步：一个特异性的测序引物与单链DNA模板结合第2步：加入四酶混合物和底物混合物

(荧光素和腺苷酰硫酸)

腺苷酰硫酸(APS):adenosine5´-phosphosulfateIII

测序过程第3步

向反应体系中加入1种dNTP，如果它正好与DNA模板的下一个碱基匹配，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)

III

测序过程

III测序过程

第4步：

在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以与腺苷酰硫酸（APS）结合形成ATP

第5步：在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以与荧光素结合形成氧化荧光素，后者发出与ATP量成正比的可见光；通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则与参入的核苷酸数目成正比第6步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在ATP双磷酸酶的作用下发生降解

（3）测序过程III

焦磷酸测序过程第7步：加入另一种dNTP，使第3－6步反应重复进行，继续DNA链合成；获得的光信号自动记录，根据获得的峰值图即可直接读取准确的DNA序列PSQ测序原理示意图无需制胶和电泳，也无需荧光或同位素标记，操作极为简便，具快速、准确、经济和实时阅读能力已从100bp至400bp10分钟内可分析96个样品的SNP,可满足高通量分析的要求该技术具有多种不同的用途，包括：

&&特定DNA片段的突变检测

&&单核苷酸多态性位点检测（SNP，SingleNucleotidePolymorphisms）

&&重要微生物的鉴定与分型等

PSQ特点PSQ发明人Thehistoryofpyrosequencing

（MethodsMolBiol.2007;373:1-14）

NyrénP.DepartmentofBiotechnologyAlbaNovaUniversityCenterStockholm,Sweden.

AbstractOnelateafternooninthebeginningofJanuary1986,bicyclingfromthelaboverthehilltothesmallvillageofFullbourn,theideaforanalternativeDNAsequencingtechniquecametomymind.ThebasicconceptwastofollowtheactivityofDNApolymeraseduringnucleotideincorporationintoaDNAstrandbyanalyzingthepyrophosphatereleasedduringtheprocess.Today,thetechniqueisusedinmultidisciplinaryfieldsinacademic,clinical,andindustrialsettingsallovertheworld.Thetechniquecanbeusedforbothsingle-basesequencingandwhole-genomesequencing,dependingontheformatused.3DNA测序的策略测序前，需要考虑以下因素待测DNA分子的性质测序目的：是对未知序列的测序还是对已知序列的验证性测序现有设施及测序方法

3-1已知序列的确证性测序策略

确证性测序（confirmatorysequencing）是对已知的核酸序列进行鉴定和证实例如：在临床分子诊断中，对有遗传倾向的病例进行相关基因的检测（有无突变等）

再如：PCR产物是否错配多数情况下，确证性测序的DNA片段较小，一套反应即可获得局部区域的核苷酸序列

最适合的方法？3-2未知序列的从头测序策略从头测序（denovosequencing）是指通过测序以确定未知序列DNA片段的准确长度及其核苷酸排列顺序其测序策略因待测DNA的长度而异

一般而言**1kb左右的待测DNA可选用定向测序策略**过长的DNA可选用随机测序策略

1）定向测序策略（directedsequencing）

定向测序：从待测大片段DNA的一端开始，按顺序进行分析，直至将待测DNA的序列全部测完该类方法具有方向性，不会出现大量重复测定的现象，经济

具体方法：

**引物步入（引物步查、引物步移）**嵌套缺失以引物步入策略（primerwalking）为例是从待测DNA片段的3’端开始，利用载体上的序列设计第一次反应的引物，测定一段DNA序列，然后根据这次测序结果，设计下一次反应引物，循序渐进，直至得到靶DNA的全部序列引物步入法是一种渐进性测序策略，也是最简单的策略它适合采用双脱氧测序法适合于较小片段的测序速度慢、耗时、成本高：

每步都需要：测序、数据分析、新引物设计和合成但是，引物合成成本渐降低，加上操作简单，所以也有优势1999年12月用“逐个克隆策略”获得第一条人类染色体（22号）完全序列

2）随机测序策略

（randomapproach）包括：鸟枪战略（shotgunstrategy)

人工转座子法

(artificialtransposonsequencing)共同特点:无特定方向性，随机对靶DNA进行测序，最后通过计算机拼装而得到完整的序列信息Shotgun测序步骤DNA的提取和纯化载体预备DNA片段制备：用超声波随机切成约2kb的子片段把这些子片段装入载体，构建亚克隆基因组文库用重组分子转化细菌，进行扩增和从中提取大量扩增的重组分子高效、大规模的应用酶法对各子片段进行测序将所有测得的序列集合、重叠排列和组装，以确定待测DNA的完整序列填补缺口！！！DNA整体切成小段小段和载体结合结合后进行测序随机测序与序列组装序列组装原理:

直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆，

然后依次向两侧邻接的序列延伸优点:不需预先了解任何基因组的情况ABCABCABCABC小片段测序计算机拼装DNA的鸟枪法序列分析技术原理

组装基因组的拼图游戏基因组测序像是在做一个巨大的智力拼图首先，先把基因组切成小片段其次，将每个片段测序最后，按正确的顺序来排列这些片段就像上面提到的，这些片段之所以能够重新拼起来是因为它们之间有部分重叠，一个片段就能和相邻片段正确拼接，这犹如每个拼图块的独特的边缘使整个拼图只有一种拼法组装基因组的拼图游戏完成序列的公认标准是任何一个碱基的正确率是99.99%，就是说每10000个碱基最多不能有超过一个错误。为了达到这一目标，每一个碱基平均要被测序9次（也就是说，要有9倍的覆盖深度）。这一准确度是必需的其可迅速获得90%左右的序列信息，并且所获得的序列由许多序列积累产生，结果准确缺点：1）后期大量重复测序导致效率降低（因为后来测得的多是已经测序的片段的重复），工作量大，通常要测定比实际靶序列多出4～7倍的序列2）计算机难以对重复序列进行分析，因此对含大量重复序列的靶序列，其分析困难3）可能会有个别序列始终不能被测定，即gap：

一般通过合成特异寡核苷酸引物去测剩余少量未知片段优点：成本低、快速、易于自动化操作鸟枪法(Shotgun)测序的问题1

gap的存在鸟枪法(Shotgun)测序的问题2

拼接错误,因为重复序列的存在实例:1995年流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装超声波打断纯化的基因组DNA↓琼脂糖电泳收集1.6∼2.0Kb的区段、纯化

↓构建到质粒载体中↓随机挑选19687个克隆,进行28643次测序,得到可读顺序为11631485bp↓组装成140个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群,↓历时3-4个月，耗资100万美元2000年3月用“全基因组鸟枪法”获得果蝇基因组序列基因组测序概述

DNA测序，用于描述解读四个遗传字符（A、C、G、T）在DNA链上的排列次序的实验过程。基因组怎样测序？选择物种从细胞中分离DNA，获得大量高质量的样品把经纯化的DNA随机切割成大小合适的、重叠的片段把DNA片段插入载体中，这就可无限扩增（“克隆”）测出每一DNA片段的碱基顺序

确定片段间的重叠，把序列组装成最终的基因组序列序列解读--生物信息学

拼接后的基因组序列不过是一长串无意义的碱基排列，必须经过注释，才能真正具有价值基因组的注释就是从基因组中找到特定的基因，基因编码的蛋白质及别的令人感兴趣的序列的信息与测序本身相比，注释基因组是一项更艰难的任务生物信息学跨越了生物学、计算机科学和数学的界限，涉及到对生物学数据的存储、分析和整合各个过程，从而来鉴定基因、确定基因结构以及预测基因的功能

本部分的要求1.掌握SANGER法和焦磷酸测序法的原理2.熟悉测序策略3.熟悉自动化测序原理本讲内容1DNA测序概述2第一代测序技术（G1）1）G1之Sanger法及其自动化（1）G1.10Sanger法（手工测序，1977）（2）G1.11(自动：PAGE）（3）G1.12(自动：HPCE)

2）G1.2化学法（1977）和G1.3杂交测序法

-略

3）G1.4焦磷酸法(1987)3测序策略4G25G36G47基因组测序成果

HGP花费近30亿美元、13年和很多人力

第一代测序技术以其可靠、准确、长读长而被广泛应用；但是，去致命缺陷是速度慢。HGP耗时13年~~~基因组测序呼唤新技术基于大规模平行测序(massivelyparallelsequencing)思想的第二代基因测序技术应运而生。4第二代测序技术又叫“下一代测序技术”

(next-generationsequencing，NGS)

或“深度测序技术”其核心：DNA片段的单分子分离、扩增和测序其优势：不需要克隆制备高通量数据获取能力强4G2-NGS

三大代表性技术

2005年，454

公司推出FLX焦磷酸测序平台(454

FLX

pyrosequencing

platform）

**

454公司：新一代测序技术的奠基者

**随后，Roche以1.55亿收购454公司

**自此ABI的领先地位面临挑战2006年，Solexa公司研发出Solexa基因组分析平台

（Genome

Analyzerplatform）；该公司2007年被Illumina公司以6.15亿美金收购，促成GenomeAnalyzer的商品化2007年，ABI迅速收购测序公司AgencourtPersonalGenomics，并推出自主研发的

SOLiD测序仪(ABISOLiDsequencer）4G2

1）基本原理和工作流程（1）基因组DNA片段化及其文库制备（2）由PCR呈数百万倍地扩增各DNA片段（3）几十万～几百万个片段并行测序：

利用DNA聚合酶或连接酶和引物对模板进行一系列的碱基延伸或连接,通过显微设备观察并记录连续测序循环中的光学信号（荧光或化学发光）（4）计算机分析、拼接和组装，获得完整的DNA序列信息“大规模的微阵列分析技术”G2有类似的工作流程：都要经过克隆扩增，以加强测序过程中的光学检测的灵敏度2）以Roche/454为例简介其原理和过程2005年底，Roche/454公司推出革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统（GenomeSequencer20System），被“Nature”杂志作为里程碑事件报道2006年，Roche推出性能更优的第二代基因组测序系统(GenomeSequencerFLXSystem,GSFLX)2008年10月：全新的GSFLXTitanium系列试剂和软件的补充，让GSFLX的通量提高5倍，准确性、读长也进一步提升2）Roche/454简介（1）样品输入并片段化该系统支持各种来源的样品

（基因组DNA、PCR产物、cDNA、小分子RNA等）

*大的样品（如基因组DNA）被打断成300～800bp的片段*小分子的非编码RNA或PCR扩增产物，无需此步

2）Roche/454简介

（2）文库制备：

借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA片段上

（接头也将用于后续的纯化、扩增和测序步骤）

具有A、B接头的单链DNA片段组成样品文库接头：adapter2）Roche/454简介（3）一个DNA片段＝一个磁珠单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上每一个磁珠携带一个独特的单链DNA片段磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，即形成：

只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器2）Roche/454简介（4）乳液PCR扩增每个独特的片段在自己的微反应器里独立扩增，

而无其它竞争性或者污染性序列的干扰全部片段的文库是平行扩增的

（对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝）随后，油包水的乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上一个DNA片段＝一个磁珠2）Roche/454简介（5）一个磁珠＝一条读长将测序试剂和携带DNA的磁珠加入PTP板：板上含350万

个光纤组成的小孔，Φ29μm，只容一个磁珠（20μm

）将PTP板放置在GSFLX中，测序开始：

**放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基**如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸

请问：该测序原理是？

PTP：PicoTiterPlate2）Roche/454简介在ATP硫酸化酶和萤光素酶的作用下，焦磷酸经过合成反应和化学发光反应，最终将萤光素氧化成氧化萤光素，同时释放出光信号光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号由此一一对应，就可准确、快速地确定待测模板的碱基序列2）Roche/454简介（6）数据分析：GSFLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4～6亿个碱基信息；准确率在99%以上

2）Roche/454简介GSFLX系统的流程

一个片段=一个磁珠=一条读长

Onefragment=Onebead=Oneread主要缺陷：

来自同聚物，即相同碱基的连续掺入时，同聚物的长度就需要从信号强度中推断出来

依据信号强度、很难以很高的可信度将7个A和8个A区分开来，于是可能产生误差因此，该测序平台的主要错误类型是

插入或缺失（多读或少读）

而非替换（非读错）2）Roche/454简介该公司第一个测序对象是JamesWatson

两年+100万美元相对于HGP时代(13年+30亿美元），是质的飞跃在同代测序平台中，454平台的突出优势是读长目前读长为450bp454平台的测序成本比其他平台要高很多，不过对于需要长读长的应用，它仍是最理想的选择沃森：他已经授权454生命科学公司在测序完成后公开他的基因组排序，但他自己不想知道的部分信息要保密。比如，他不想知道自己的ApoE基因是否变异，因为该基因变异是罹患老年痴呆症的标志Illumina公司的GenomeAnalyzer

Solexa测序技术原理（了解，不要求）

首先将基因组DNA打断成几百个碱基的小片段，两端连接接头。随后，单链、两端有接头的DNA片段结合到表面带有单链引物的专利芯片上，形成“桥式”结构并进行扩增。经过30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，芯片上形成了上百万个单克隆“DNA簇群”

在随后的合成测序反应过程中，向上述芯片中同时加入引物、四种不同荧光染料标记的dNTPs和DNA聚合酶。由于核苷酸的碱基末端被保护基团封闭，因此每次反应只掺入一个碱基扫描读取该次反应的颜色后，该保护基团被除去，继续进行下一轮反应。利用这种专利的“可逆性末端终结反应”，反复循环，得到片段的精确序列

Illumina公司的GenomeAnalyzer由于采用了可逆阻断技术（即在dNTP上连接可剪切的阻断基团），Solexa测序的每一步只延伸一个碱基，不会出现类似于454测序的同聚物影响准确性的问题，因此其单碱基准确性较高但随着读长的增加，荧光信号会有所衰弱，所以越“靠后”的碱基准确性会逐渐降低，这也是Solexa测序读长受限的一个主要因素

1.文库制备

将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末端加上接头(adapter)。

2.产生DNA簇

利用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA片段变成单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。另外一端（5’或3’）随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定”住，形成“桥(bridge)“。反复30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆DNA簇。DNA簇产生之后，扩增子被线性化，测序引物随后杂交在目标区域一侧的通用序列上。

3.测序

GenomeAnalyzer系统应用了边合成边测序（SequencingBySynthesis）的原理。加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。这些核苷酸是“可逆终止子”，因为3’羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。4.数据分析

自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次分析。Illumina测序的过程ABI的SOLiD技术平台（连接测序）SOLiD：SequencingbyOligonucleotideLigationandDetection大规模扩增和高通量并行测序其无以伦比的准确性、系统可靠性和可扩展性更让它从其他新一代测序平台中脱颖而出ABI的SOLiD技术平台与其它所有测序仪一样，测序错误在所难免，关键是对测序错误的评价和后续处理

由于SOLiD系统采用了双碱基编码技术，在测序过程中对每个碱基判读两遍，从而减少原始数据错误。双保险确保了SOLiD系统原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%

三者中：它准确度最高三大新一代测序仪“才艺大比拼”

AgencourtBioscience公司研究人员用了这3个不同的平台：Roche/454的FLX、Illumina1G和ABI的SOLiD系统对一种树干毕赤酵母的突变株进行测序结果表明：这三种新一代的高通量测序技术都能够完全并准确地测定突变菌株的基因组3）G2的共同点（1）通过有序或无序的阵列配置可以实现大规模的并行化,实现极高的测序通量！！

相对于传统测序的96～384道毛细管测序，G2技术一次实验可以读取40万～400万条序列，这样庞大的测序能力是传统测序仪所不能比拟的（2）不采用电泳,设备易于微型化.相对于第1代测序技术,样本和试剂的消耗量得以降低

（3）读取长度从25～450bp

人类基因组大小：32Mb=3.2Gb市场占有情况（2010年）英国两名学者绘制高通量测序仪在全世界的分布图http://pathogenomics.bham.ac.uk/hts/目前全世界总共购买1599台高通量测序仪（包括第二代和第三代），分布在527个研究中心，平均每个中心拥有3台测序仪美国702台，其次中国199台，英国132台之后是德、加、澳大利亚、西班牙、韩国、法、日台湾也拥有22台高通量测序仪，超过香港的13台与美国的分布广泛不同，中国集中在：深圳、北京和江浙沪深圳华大基因：不愧为全世界规模最大的基因组学研究中心，166台高通量测序仪，占全国80%以上，也是全世界拥有最多高通量测序仪的基因组中心，领先于美国哈佛-麻省的Broad研究院（114台）；其中，IlluminaHiSeq137台，SOLiD27台，Roche/454一台，IonTorrent1台北京：北京基因组研究所拥有15台高通量测序仪，分别为：9台SOLiD3/4、5台IlluminaGA2和1台454；而北京贝瑞和康生物技术有限公司也拥有2台测序仪（Illumina的GA2和HiSeq，提供测序和产前诊断业务）

测序的质量值首先，碱基质量值（Q）

是衡量测序质量的重要指标，Q越高即碱基被测错的概率（P）越小，其计算公式为Q=-10lgP。例如，Q20和Q30分别代表碱基被测错的概率为1%和1‰。Illumina官方一般以Q30作为评价标准，以目前最常用的HiSeq2000平台2×100PE测序为例，Illumina官方保证大于80%碱基准确度达Q30“千年基因”在合同中严格保证大于85%碱基准确度达Q30

Macrogen集团由首尔大学于1997年成立，2000年上市，目前已在中国、美国、日本、澳大利亚、欧洲等成立多家分部。Macrogen中国分部千年基因致力于提供全球最高质量的高通量测序、生物信息分析及相关技术支持。

就各测序平台的销售情况而言，Illumina无疑是最大的赢家，总共售出994台ABI：296台SOLiD罗氏454：262台这些数据也与Frost&Sullivan的统计结果基本相符

根据Frost&Sullivan对2010年NGS市场份额的统计

Illumina占69%，LifeTech占16%，Roche占15%

（当然，这些数据非绝对准确，仅供参考）5）新技术的意义将过去的种种梦想都变成现实未来，它将不仅改变生命科学，甚至可能改变我们的生活也许，几年后的出生体检报告就是一份个人基因组图谱，告诉你与生俱来的有哪些遗传变异,WHENANDHOW干预之2008十大突破：基因组测序多快好省这代测序技术入选《Science》杂志的十大突破

（2007年被评为年度技术）在新一代测序技术的推动下，2008年的基因组研究硕果累累：

第一个个人第一个中国人第一个女性第一个癌症病人第一个非洲人基因组图谱陆续出炉这与第一个人类基因组图谱HGP的13年形成鲜明对照测序通量与费用的巨变HGP时代:13年时间

+30亿美元随后，依靠ABI的DNA测序仪与相关技术，人类基因组的破译费用已降为1000万～1500万美元第二代测序仪问世后，其成本大幅降低，但目前测序一套个人基因组图谱的成本仍高达数十万美元，大约6周时间

美国国家基因资源中心主席StephenKingsmore把经过完整注释和准确分析的个人基因组标价为25万$

两个月后，这项服务终于开张第一位吃螃蟹的客户是来自英国一家风险投资机构的HauserPartner博士他本人表示非常兴奋，“我希望了解有关基因变异的信息，以便让我的医生根据药物基因组学的信息来指导用药和药物剂量。这是个性化医疗的开始，我很高兴站在它的前沿。”

200906：Illumina公司宣布将向客户提供高质量的个人基因组测序服务，价格为4.8万美元G2的应用1）从头测序、重测序和个体基因组测序2）SNP分析3）转录组及表达谱分析4）小分子RNA的研究重测序：对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序,并在此基础上对个体或群体进行差异性分析

G2存在的问题第二代测序技术的出现，使得基因研究领域快速发展，测序成本也大大降低。全基因组测序：

2001年：100万美元在G2帮助下，2011年：1万美元借此浪潮，著名的测序设备生产商Illumina公司也异军突起，股票价格由2001年的15.94美元，上涨到如今的168美元，市值达217亿美元但如今的第二代测序技术也面临着诸多问题，一定程度上阻止了基因测序的大众化趋势G2存在的问题1）测序平台和测序成本仍然十分高昂：仪器普遍高达40～70万美元，而一个全基因组测序至少需要2000～5000美元，同时花费几周的时间；2）依赖于基因样品的扩增过程，大量的洗脱过程，即增加了成本和样品制备的时间，也容易出现错误累积；3）读长为150～400bp，不能满足更高科研需要；4）大量的数据拼接工作和光学读取导致的大体量数据，让分析变成了耗时耗力的工作。G2存在的问题现在，G2已处于市场发展的中后期阶段，其不足性将在未来更加明显。罗氏公司也已决定于2016年停止其第二代测序平台454的生产。那么什么样的技术才能“担当”起人们对基因测序领域的期望?

5第三代测序技术在第二代测序技术的协助下，个人基因组图谱正在如火如荼地绘制中，但它很快就遇上了强劲的对手——第三代测序技术，也被称为：

下下一代的测序

next-next-generationsequencing各大公司争先研发和推出测序仪目标：破译人类基因组的费用降低到100～1000美元未来一天，会是每个新生婴儿的例行服务项目5G3的公司和技术包括1）DNA纳米阵列与组合探针锚定连接测序法

美国加州CompleteGenomics公司发明并投资4650万美元2）HelicoBioScience公司的“单分子测序技术”

（斯坦福）3）基于寡核苷酸合成技术的液相序列捕获系统

（麻省和哈佛；NatureBiotechnology.2009;27(2):182-94）美国太平洋生物科学公司（PacificBiosciences）第三代单分子测序的开山之作

斯坦福大学生物工程师StephenQuake，同时也是Helicos公司的创始人之一：在两名研究人员的协助下，利用一台Heliscope单分子测序仪（边合成边测序）和4次数据收集运行，花了4周时间，试剂花费为4.8万美元，完成了对白人男子的基因组测序。

Heliscope的主要优势：高产量，文库制备简单，不需要DNA扩增或连接。

“如果有三台Heliscope，我一个星期就能完成。”

NatBiotechnol.2009Sep;27(9):847-52.5第三代测序技术

以Pacific

Biosciences公司的RS系统为代表以单分子实时测序（SingleMoleculeRealTime,SMRT)为主要特点专利：SMRTCell含有1.5万个纳米级、零模波导孔对零模波导中的单个荧光分子进行高灵敏度检测，从而快速获得

DNA序列信息与前两代相比，最大的特点：单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增PacBioSMRT技术边合成边测序，以SMRT芯片为测序载体基本原理是：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基（dNTP）；在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。同时，该DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一（读长主要与酶的活性维持有关；主要影响酶活性的因素是激光对其造成的损伤）PacBioSMRT技术的一个关键：

怎样区别：反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景ZMW（零模波导孔）原理在一个反应管(SMRTCell，单分子实时反应孔)中有许多圆形纳米小孔，

即ZMW(零模波导孔)，外径100多纳米，比检测激光波长小(数百纳米)，激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围(体积20X10-21L)里，正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而将背景降到最低同理：可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况：如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，依此来检测甲基化等PacBioSMRT技术测序速度很快，每秒约10个dNTPs其测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），达到15%但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错PACBIO（全球首个第三代测序平台）2011-4推出；2012年一季度发布PacBioRS的新版本C2试剂，将平均读长将从开始的1300bp提升至2500～3000bp！最长读长可超过10000bp令人惊叹的数字！经典的Sanger测序长度也就是1200bp左右长读长的好处：DeNovoAssembly时，目前遇到的主要困难在于如何跨越那些重复区域以及高/低GC含量的区域，从而完成整个基因组的拼接相当于同样的一幅图，用大的碎片来做拼图，由于大碎片比小碎片的识别度要高，因此完成拼图的难度就可以大幅降低。同NGS通常100-150bp的读长相比，PacBioRS的平均读长提高近20倍。试想：同样的一幅拼图，被碎成1万片和500片，哪个更容易拼接？其准确度：目前单分子的原始测序准确度在85～92%，平均值为87%由于PacBio上产生的错误是随机错误，且错误率并不随着读长增加而升高。因此其一致性准确度可随着测序覆盖深度的增加而提高。当测序覆盖深度达到30×时，PacBio的一致性准确度可以达到99.999%在NGS平台上，文库制备时必须要先进行PCR扩增，PCR过程中的bias或者mismatch等将无法在测序时修正，也就意味着这些错误会变成系统误差，且无法通过增加测序覆盖深度来消除测序速度目前PacBio上所使用的DNA聚合酶的合成速度大概是1-3个碱基/秒，由于在该平台上，聚合酶合成的过程就是序列解读的过程，即测序速度>100碱基/min从样品制备到获得碱基序列的全部流程可在1天内完成6第四代测序技术

OxfordNanoporeTechnologies

（也有被并入第三代）

纳米单分子测序技术与以往的测序技术皆不同：它是基于电信号、而不是光信号的测序技术其关键之一：设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度，而每种碱基所产生的电流变化幅度是不同的，灵敏的电子设备检测这些变化，从而鉴定所通过的碱基OxfordNanoporeTechnologies

不需要对

DNA

进行生物或化学处理，

而采用物理办法直接读出

DNA

序列。

原理：

单个碱基通过纳米尺度的通道时，

会引起通道电学性质的变化；

理论上，

A、

C、

G和

T

四种不同的碱基化学性质的差异会导致它们穿越纳米孔时引起的电学参数的变化量也不同，

对这些变化进行检测可以得到相应碱基的类型。

OxfordNanoporeTechnologies虽然纳米孔测序的优点十分明显，与前几代技术相比在成本、速度方面有着很大优势，但是目前还处在起步阶段，从测序原理到制造工艺都存在问题，一些技术也都只停留在理论阶段。目前似乎还没有该技术的应用报道6G4纳米孔测序的主要特点：1）读长很长，大约在几十kb，甚至100kb；2）错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，而不是聚集在读取的两端；3）数据可实时读取；4）通量很高(有望在一天内完