内毒素及葡聚糖定量检测的临床评价-安贞左主任

细菌内毒素及

(1-3)--D-葡聚糖定量检测

与临床评价

左大鹏首都医科大学北京安贞医院感染科内毒素的定义

英文称作Endotoxin，是G-菌细胞壁上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素的主要化学成分为脂多糖（LPS）中的类脂A。

(1-3)--D-葡聚糖定义

葡聚糖为真菌细胞壁结构成分之一，占其干重的80%-90%。其中1-3--D-糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分支状(1-3)--D-葡聚糖残基作为侧链。对于(1-3)--D-葡聚糖在深部真菌感染中的意义，与内毒素在G-阴性杆菌感染中的意义类似。内毒素血症

一、细菌内毒素生物活性1、发热反应：内毒素直接作用于下丘脑体温调节中枢，或作用于白细胞使之释放内原性致热原。2、促使血管活性物质如缓激肽、组胺、5-羟色胺、血管紧张素等释放，使血压下降，导致微循环障碍。3、引起白细胞和血小板减少，激活凝血、纤溶系统，产生出血倾向；弥漫性血管内凝血。4、经C3旁路或经典途径激活补体。5、直接或间接损害肝脏，引起糖代谢紊乱及酶学、蛋白代谢的改变。6、激活白三烯、前列腺素、巨噬细胞、单核细胞及内皮细胞活性。二、内毒素血症产生原因

内毒素血症是由于血中细菌或病灶内细菌释放出大量内毒素至血液，或输入大量内毒素污染的液体而引起。内毒素血症分为内源性和外源性两类。

1、内源性内毒素血症发生的原因。

在严重创伤、感染等应激状态下可出现，此时机体全身网状内皮系统功能障碍，免疫机能下降，肠道吸收的内毒素过多而超过机体清除能力；肠道粘膜缺血、坏死、屏障破坏，大量内毒素释放入血；肠道吸收的内毒素因肝功能障碍由侧枝循环直接入体循环；某些组织、器官的感染引起外源性内毒素入血。

（1）肠道内毒素的吸收： 正常机体内菌落失调后，肠道内内毒素可被大量吸收入血。（2）败血症时血中细菌的释放： 革兰阴性杆菌败血症时，细菌在机体血液内大量繁殖，死亡解体的细菌可释放出大量内毒素。（3）有效的抗菌治疗后，由于血中细菌大量死亡崩解，可加重内毒素血症。因此，在临床上可能出现感染控制而以器官损害为特点的病情继续恶化的情况，此时需要抗内毒素治疗。2、外源性内毒素：由于治疗的需要输入了含有细菌内毒素的液体、药物或血液等。因此，内毒素检测是制药工业中质量控制的重要环节。三、内毒素血症的临床症状

内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素的抵抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变化，出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神经系统症状，以及休克等。内毒素可引起组胺、5-羟色胺、前列腺素、激肽等的释放，导致微循环扩张，静脉回流血量减少，血压下降，组织灌流不足，缺氧及酸中毒等。

内毒素血症最严重的后果是可以出现在多系统的多种疾病中，通常导致致死性感染性休克、全身炎症综合征、多器官功能衰竭、弥漫性血管内凝血等，病死率极高。

图1LPS分子结合附在巨噬细胞表面的CD14结合位点上，通过释放细胞因子激发全身性炎症反应。四、各类疾病内毒素血症的发生率

肺炎100%、尿路感染70-80%、腹腔感染72-84%、烧伤85%、急性胰腺炎90%、败血症70%、急性肝炎37-64%、暴发性肝炎58-100%、丙肝61.54%、胆石症伴急性梗阻性化脓性感染85%、多器官功能衰竭100%。

五、内毒素检测的临床意义革兰阴性菌败血症是住院病人死亡的重要原因。革兰阴性菌释放的内毒素是造成革兰阴性菌败血症的真正原因。检测血浆和体液中的内毒素含量对诊断革兰阴性细菌感染、支原体感染有重要的临床参考意义，特别当缺乏直接细菌学证据时，为临床医生制定抗菌素治疗方案提供参考。1、细菌性感染的辅助诊断、治疗和预后判断（1）全身性细菌感染：全身性细菌感染主要见于败血症。革兰阴性细菌性败血症尤常并发内毒素血症。这种败血症较常见的致病菌为沙门氏菌属、脑膜炎双球菌属及拟杆菌属。这些致病菌多通过泌尿道、肠道、胆道及呼吸道而引起感染，也可通过外伤、外科手术、导管检查或留置，以及器械操作等途径而进入血液，并大量繁殖引起败血症，从而造成内毒素血症。

另外一些低致病力、如大肠杆菌、克雷伯氏菌、产气杆菌、沙雷氏菌、变形杆菌和绿脓杆菌它们可导致泌尿系统感染、呼吸系统感染和伤口感染引起败血症。上述各类感染的患者多伴有免疫功能降低，尤其是体液免疫功能低下。因此免疫防御和治疗非常重要。对患者进行血浆内毒素测定，可以指导治疗，及时控制感染。细菌性脑膜炎发病急，因此寻求一个快速、简便、可靠的检测病原方法，是临床抢救病人，提供特异抗菌药物治疗的重要依据。迄今多家报道一致认为鲎试验检测脑脊液中内毒素，是诊断革兰阴性细菌脑膜炎的一个快速、可靠、敏感的方法。

（2）局部性细菌感染：局部性细菌感染造成内毒素血症的有肺炎、胆囊炎、烧伤合并感染、穿孔性腹膜炎、化脓性胆管炎、肝脓肿、肾盂炎、卵巢囊肿扭转伴尿路感染、肠结核及肺结核伴绿浓杆菌感染、非特异性出血性小肠炎及肾周围炎等。其致病菌多为革兰阴性杆菌。对尿液进行内毒素测定可成功地检出革兰阴性细菌菌尿症，也可检出厌氧性性阴性杆菌菌尿症且方法简便、快速，结果误差小。

我们统计了临床资料相对比较齐全的病例87例，其中病毒性感染17例（其中上呼吸道感染13例，传染性单核细胞增多症4例）、肺炎45例（其中G+菌感染20例、G-菌感染9例，细菌类型不明确的12例，所有肺炎患者均有胸部X影象学证据）、上尿路感染17例（有细菌学证据11例，缺乏细菌学证据6例）、其他感染8例。表187例不同感染病人血清内毒素检测结果-----------------------------------------------------------------------疾病例数内毒素水平（pg/ml，Xsd）-----------------------------------------------------------------------正常人103.483.05病毒性感染174.263.79G+球菌感染3027.6515.96*肺炎2440.1327.45*化扁512.368.26皮肤14.07-----------------------------------------------------------------------表187例不同感染病人血清内毒素检测结果（续）---------------------------------------------------------------------------疾病例数内毒素水平（pg/ml，Xsd）---------------------------------------------------------------------------G-杆菌感染22592.14307.28**肺炎9724.67475.36**尿路感染11269.89128.72**胆囊炎2537细菌类型不明确的感染18308.67112.11**肺炎12231.96107.58**尿路感染6399.3378.26**--------------------------------------------------------------------------说明：**表示p0.001，*表示p0.05在细菌性肺炎患者的细菌学检查中，主要根据痰涂片革兰染色判断细菌种类，24例G+菌中有15例培养出细菌，其中肺炎链球菌5例、溶血性链球菌3例、表皮葡萄球菌3例、金黄色葡萄球菌3例、模拟葡萄球菌1例；9例G-菌中有6例培养出细菌，其中大肠杆菌3例、克雷白肺炎杆菌2例、绿脓杆菌1例。其它未培养出细菌。国内另一组（南京中医药大学、泸洲医学员附属医院等）细菌性肺炎103例的血浆内毒素检测报告，其结果100%存在内毒素血症。其中除了革兰阴性杆菌、支原体、衣原体这些可直接产生内毒素的致病菌外，其他革兰阳性菌引起的肺炎，内毒素均来自肠道。第四军医大学西京医院检验科报告，革兰阴性菌肺炎22例血浆内毒素水平为160.41222.78pg/ml；革兰阴性菌菌血症10例检测水平为2671.73523.91pg/ml；而正常对照30例为3.30

1.73pg/ml。经SPSS统计软件T检验分析，有显著差异（T=2.608，p=0.025）。2、原因不明的发热内毒素是一个强力的热源物质，每毫升血液中达pg级的内毒素就能使人发烧。免疫低下儿童发烧在诊断和治疗上一直存在问题。AdaHass等人对一些检查不出菌血症和临床感染的发烧的免疫低下儿童，作了内毒素检查，其结果是所有发烧儿童在发烧期间内毒素水平均高于正常儿童水平，发烧恢复后内毒素含量都降致正常水平。这与Harris等人对成年人进行的类似研究的结果一致。因此，内毒素血症可能是免疫低下患者原因不明发烧的因素之一。因而血浆内毒素的检测可以发现隐蔽的易被忽略的感染。SanderJ.H.vanDeventer等人对473个连续发烧的病人进行血浆内毒素测定。其实验结果表明，内毒素血症是临床上预测革兰阴性菌败血症到来的有用指标（正预测值为48%），而没有内毒素血症就可以完全排除发生败血症的可能（负预测值为99%）。过去的临床工作中，找不到一个可靠的指标准确地预测病人将要发生败血症。Sander等人的研究表明，鲎试验法检测结果预测败血症的敏感性为79％，特异性为96％。从全体发烧病人有4％会发展为败血症来计算，鲎试验的阳性预测值为48％，阴性预测值为99％。凡是内毒素试验结果为阴性的病人基本上排除3日内发生败血症的可能，而内毒素阳性的发烧病人则有发生败血症的高度危险性。

3、肝脏疾病

肝脏是阻止肠道内毒素进入大循环的有效屏障，一旦肝脏功能障碍、肝脏受损后，对内毒素解毒能力大为减弱，内毒素进入血循环并经直接及间接作用引起肝外组织的损伤。肝炎病人也常并发内毒素血症。甲肝的内毒素血症发生率为58%，平均内毒素浓度为54.71pg/ml。在肝发病后第1、3、5周检测血浆内毒素，内毒素血症发生率分别为79%、37.8%、17.1%，平均值为65.5pg/ml、37.7pg/ml、26.8pg/ml。到第五周时几乎均恢复正常。其发病率和内毒素水平均随着病程的延长而下降，两者与病程均有非常显著的意义（p<0.01）。乙肝的内毒素血症发生率与病理类型有关。有文献报导急性病毒性乙肝内毒素血症发病率占51.9%，随着病情的缓解内毒素水平逐渐下降。慢性活动性乙肝时出现内毒素血症者占53.7%，并且有80%患者持续存在内毒素血症。丙型肝炎中的慢性活动性肝炎内毒素血症发病率最高，但血清丙氨酸转氨酶水平与内毒素血症发生率及含量无明显关系。内毒素血症与肝炎病情程度有密切关系。重型病毒重性肝炎内毒素血症的发生率可高达92.8%，这些病人较易并发弥漫性血管内凝血（DIC）及肾功能衰竭，死亡率高。

中日友好医院报告，在27名肝病患者中肝硬化的阳性率为100%，肝硬化患者内毒素水平明显高于对照组。肝硬化晚期时，血浆内毒素水平很高。乙肝的阳性率为88.89%，与对照组比较明显升高，随着病情的缓解内毒素水平逐渐降低。4、胆道疾病

内毒素是肠道内大量存在的革兰阴性菌细胞壁内的一种脂多糖，正常情况下来自胆汁的胆酸、胆盐及分泌型IgA等能抑制肠内菌群的过度繁殖和内毒素的产生。维持粘膜屏障的完整，阻止内毒素的吸收。梗塞性黄疸时，单核巨噬细胞系统尤其是肝脏Kupffer细胞功能受抑，肠道中胆汁缺失使内毒素池增大，致内毒素血症发生率增高。内毒素浓度与梗塞性黄疸的程度（血清胆红素）以及持续时间有一定关系，与术后并发症发生率也有密切关系。因此术前检测内毒素对预测术后病情有一定价值。已有报导术后内毒素血症发生率为50-75%。因为内毒素血症是梗塞性黄疸病人术后出现并发症和死亡的一个重要原因，所以对梗黄病人进行围手术期血浆内毒素检测有助于引导治疗，降低阻黄病人围手术期并发症和死亡的发生率。据个别报导，胆石症伴胆囊炎的内毒素血症的发生率为78%，化脓性胆管炎为20%。5、急性胰腺炎

有文献报导，急性胰腺炎的轻重程度与血浆内毒素水平呈正相关。急性胰腺炎，肠道推动力下降，肠道细菌过度繁殖，肠粘膜屏障功能损害，血浆内毒素水平增高。内毒素还可以诱导巨噬细胞大量分泌肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子是内毒素介导的休克和组织损害的关键介质。急性胰腺炎并发内毒素血症较为常见，约占66%。值得注意的是死亡病例生前均并发内毒素血症且持续存在直至死亡。因此急性胰腺炎早期测定血浆内毒素有助于判断疾病的严重程度，指导治疗。(1-3)--D-葡聚糖与真菌感染一、真菌病真菌种类很多，与细菌相比，对人致病者相对较少，约150种。近年来由于广谱抗生素、肾上腺皮质激素和免疫抑制剂的大量应用，真菌感染有明显增长。真菌病根据病变部位不同可分成浅部真菌病和深部真菌病两大类。浅部真菌病主要侵犯含有角质的组织，如皮肤、毛发和指甲等处，引起各种癣病。深部真菌病侵犯皮肤深层和内脏，如肺、脑、消化道等器官，危害性较大。

据统计，近30年深部真菌感染的发病率增加了3-5倍，真菌感染为艾滋病的重要死亡原因之一。引起深部真菌感染的病原菌主要有白色念珠菌、曲菌和隐球菌等。由于诊断困难、进展迅速、顽固难治、病死率高。如念珠菌血症,若不治疗死亡率可以达到45%～76%，侵袭性曲霉病死亡率高达55%～70%。

二、诱发深部真菌病的因素有以下几种：1、慢性消耗性疾病，如恶性肿瘤、糖尿病和尿毒症等，可使机体免疫功能和抵抗力降低。2、长期使用广谱抗生素，敏感的细菌被抑制，消除了正常菌群中与真菌相拮抗的细菌，使真菌得以大量繁殖。3、肾上腺皮质激素破坏淋巴细胞，使抗体形成减少。

4、大剂量X线照射、抗肿瘤药物和免疫抑制剂都能抑制骨髓，使中性粒细胞和巨噬细胞减少，机体的免疫功能和抵抗力降低。5、侵入性检查和治疗（如长时间静脉插管，留置导尿管和大手术）可引起局部损伤，成为真菌侵入的门户，在机体抵抗力低落时在体内繁殖致病。

三、真菌病诊断方法：临床表现，真菌形态学、免疫学和病理学。最直接的方法是能证明真菌存在于组织中，或在渗出物中可分离培养。病理组织学的改变只有少数病变具有特征性。传统的检测方法主要为血培养和组织活检，但血培养历时太长，且阳性率较低，而深部真菌感染的临床征象错综复杂，又使得组织活检缺乏典型改变，影响正确诊断，这些都使得这些方法所起的作用极为有限。四、非传统真菌检查近年来，用于检则真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查和真菌核酸检测（PCR技术）已用于深部真菌感染的实验室检测，并已成为这一领域研究的热点。1-3-beta-D-葡聚糖检测葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中，占其干燥重量的80%-90%。其中1-3-beta-D-葡聚糖占真菌壁成分50%以上，尤其在酵母样真菌中其含量可更高，其形式以1-3-beta-糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分支状1-6-beta-D-葡聚糖残基作为侧链。关于1-3-beta-葡聚糖在深部真菌感染中的作用，目前认为可能与内毒素在革兰阴性杆菌感染中的作用类似

，但目前暂未明了。

由于1-3-beta-D-葡聚糖仅广泛存在于真菌的细胞壁中，当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，1-3-beta-D-葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液（如尿、脑脊液、腹水、胸水等）中1-3-beta-D-葡聚糖含量增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫可迅速清除1-3-beta-D葡聚糖。而在浅部真菌感染中，1-3-beta-D-葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。

20世纪90年代初发现，1-3-beta-D-葡聚糖可特异性激活自鲎变形细胞溶解产物提取的G因子，此过程称为G试验。临床上，由于深部真菌感染的严重程度常常与血浆多糖的升高水平一致，故可将G试验应用于深部真菌感染的诊断（包括念珠菌感染和曲菌感染等）。

为了解G试验在深部真菌感染和真菌性发热中的诊断价值，Oba-yashi等检测了202例病员标本。1-3-beta-D-葡聚糖的血浆浓度20pg/ml为界值，41例确诊病员（以活检和培养阳性为标准）中有37例为阳性，阳性率为90%；59例其他原因所致发全部阴性，阴性率为100%。Kawayana等检测了92例病员标本以比较深部真菌感染中血清学方法和培养的临床价值，其中17例为深部真菌病确诊病员。在取自17例确诊病员的52份血标本中，45份血标本G试验阳性，与此同时，仅有10份血标本真菌培养阳性，结果显示，G试验在深部真菌感染的早期诊断中具有较高敏感性和特异性。

我们收集了8例病人，其中真菌性肺炎3例、真菌性尿路感染2例、真菌性肺脓肿2例、真菌性腹泻1例。具体检测结果见表2。表28例1-3-

-D葡聚糖真菌葡聚糖检查结果（pg/ml）------------------------------------------------------------------------病人

临床诊断培养结果

检测结果------------------------------------------------------------------------65/M肺炎

白色念珠菌79.273/M肺炎

热带念珠菌45.222/F肺脓肿

毛霉菌480.947/M肺脓肿

烟曲霉菌235.169/M肺炎

热带念珠菌39.572/F尿路感染

光滑念珠菌50.276/M腹泻

白色念珠菌22.468/F尿路感染

近平滑念珠菌30.6---------------------------------------------------------------------------第四军医大学西京医院检验科报告，深部真菌感染35例，均经显微镜检查和培养证实，其血浆1-3-beta-D-葡聚糖检测最高168.9pg/ml，最低14.93pg/ml，平均值为54.06

36.13

pg/ml；而正常对照组30例，检测结果最高7.29pg/ml，最低0.45pg/ml，平均值为2.83

2.4

pg/ml57，差异非常显著（t=7.741，p

0.001）上述35中病例均为念珠菌感染，其中白色念珠菌23株，热带念珠菌8株，季也蒙念珠菌1株，克柔念珠菌1株，光滑球拟假丝酵母菌2株。他们认为，如果以10pg/ml为cutof