原核基因表达调控(2)-08

第六章基因的表达与调控(上)

——原核基因表达调控模式石晓卫细胞工程教研室E-mail:xwshi205@126.com第四节色氨酸操纵子（trpoperon）内容提要：色氨酸操纵子的结构色氨酸操纵子的阻遏系统色氨酸操纵子的弱化机制

调控基因结构基因

催化分枝酸转变为色氨酸的酶

trpRtrp一、色氨酸操纵子的结构trpR,阻遏蛋白P，-40~+18

O,-21~+1L,+1~+162结构基因t,A下游36bp,

t＇,t下游250bp，基因组成磷特点:(1)trpR和trpABCDE不连锁（相距很远）；

(2)操纵基因在启动子内；

(3)有衰减子(attenuator)/弱化子；(4)启动子和结构基因不直接相连，二者被前导序列(Leader)所隔开。二、trp操纵子的阻遏系统低Trp时：阻遏物不结合操纵基因；高Trp时：阻遏物+Trp

结合操纵基因1、TrpR

四聚体阻遏蛋白＋trp→

有活性的阻遏物SNE299＋trpO→不转录2、阻遏蛋白的结合位点

trpO-21~+1，反向重复序列trpP-40~+18活性阻遏物与trpO的结合与RNApol与启动子的结合发生竞争。操纵子3、阻遏系统主管转录是否启动粗调开关三、trp操纵子的弱化机制衰减子（attenuator）/弱化子前导序列（leadersequence）1.弱化子：

DNA中可导致转录过早终止的一段核甘酸序列（123-150bp区）。123~150RepressormRNAtrprepressor

研究引起终止的mRNA碱基序列，发现该区mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构，有典型的终止子特点。POE4321LDNARNAATGTGA2trpcodons14322.前导肽

前导肽14aa3.前导序列：在trpmRNA5'端trpE基因的起始密码前一个长162bp的mRNA片段。4、弱化机制

研究发现，在高浓度Trp和低浓度Trp时，Trp操纵子的表达水平相差600倍，然而阻遏作用仅使转录降低70倍。另外使阻遏物失活突变不能完全消除Trp对Trp操纵子表达的影响。说明Trp操纵子的这种调控与阻遏物的控制无关。这就是弱化作用。

阻遏系统是一个粗调开关，主管转录是否启动；Trp操纵子对应于Trp的生物合成还有另一个系统进行细微调控，并决定已经启动的转录是否进行下去。在这个系统中酶的浓度根据氨基酸浓度的变化而受到调节。这个细微调控是通过转录达到第一个结构基因之前的过早终止来实现的，细胞中色氨酸的浓度是实现过早终止的根本原因。

1︰2暂停结构2︰3抗终止构型3︰4终止构型UUUU……34UUUU3’34核糖体前导肽前导mRNA1.当色氨酸浓度高时转录衰减机制125’

trp密码子衰减子结构就是终止子可使转录前导DNAUUUU3’

RNA聚合酶终止UUUU……342423UUUU……核糖体前导肽前导mRNA15’

trp密码子

结构基因前导DNA

RNA聚合酶2.当色氨酸浓度低时Trp合成酶系相关结构基因被转录序列3、4不能形成衰减子结构为什么需要阻遏体系？

当大量Trp存在时，阻遏系统起作用，阻遏物与之结合，阻止非必需的先导mRNA合成，使这个合成系统更加经济。trp操纵子具有双重调节体系？阻遏作用与弱化作用的协调为什么需要弱化系统？

当trp浓度低时，阻遏物从有活性变为无活性，速度极慢，不能很快引发trp合成。因此需要一个能快速作出反应的系统，以保持培养基中适当的Trp水平。

弱化子能较快地通过抗终子的方法来增加Trp基因表达，迅速提高内源色氨酸的浓度。

细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停下来。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少；弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少。它通过前导肽的翻译来控制转录的进行，在细菌细胞内这两种作用相辅相成，体现着生物体内周密的调控作用。细菌演化出弱化系统的生物学意义

通过tRNA荷载与否进行调控，更为灵敏；氨基酸的主要用途是合成蛋白质，因而以tRNA荷载为标准进行调控更为恰当；两个调控系统，避免浪费提高效率：阻遏系统高水平trp时，不转录

低水平trp时，转录

弱化系统细调原核生物细致的精细调控机制增强原核生物对环境的适应性

经济Contents基因表达调控的基本概念原核基因调控机制乳糖操纵子色氨酸操纵子其他操纵子转录后水平上的调控第五节其他操纵子一、半乳糖操纵子(galactoseoperon)异构酶(galE)乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galT)

半乳糖激酶(galk)gal操纵子的特点：①它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录；②它有两个O区，一个在P区上游，另一个在结构基因galE内部。因为半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人们猜想葡萄糖存在时半乳糖操纵子不被诱导，但实际上有葡萄糖存在时，gal操纵子仍可被诱导。现已分离到一些突变株，其中一类突变株能在不含葡萄糖的培养基中高水平合成半乳糖代谢酶类（gal结构基因高效表达）；而另一类突变株中gal基因的表达完全依赖于葡萄糖，培养基中如无葡萄糖存在，这些细菌的gal基因不表达，不合成半乳糖代谢酶类。分析gal操纵子P-O区的DNA序列发现，该操纵子确实存在两个相距仅5bp的启动子，可以分别起始mRNA的合成。每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2。从S1起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时，才能顺利进行，RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖、CAP和较高浓度的cAMP。从S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖，高水平的cAMP-CAP能抑制由这个启动子起始的转录。当有cAMP-CAP时，转录从S1开始，当无cAMP-CAP时，转录从S2开始。S1S2S1起始的转录不依赖于葡萄糖S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖为什么gal操纵子需要两个转录起始位点？半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质--尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大肠杆菌细胞壁合成的前体。在没有外源半乳糖的情况下，UDP-gal是通过半乳糖差向异构酶（来源？）的作用由UDP-葡萄糖合成的，该酶是galE基因的产物。生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。现在设想只有S1一个启动子，那么由于这个启动子的活性依赖于cAMP-CRP，当培养基中有葡萄糖存在时就不能合成异构酶。S1S2半乳糖存在、葡萄糖不存在时，S1启动S1S2假如唯一的启动子是S2，那么，即使在葡萄糖存在的情况下，半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态，这无疑是一种浪费。无论从必要性或经济性考虑，都需要一个不依赖于cAMP-CAP的启动子（S2）进行本底水平的组成型合成，以及一个依赖于cAMP-CAP的启动子（S1）对高水平合成进行调节。即只有在S2活性完全被cAMP-CAP抑制时，调控作用才是有效的。半乳糖、葡萄糖存在时，S2启动，浪费半乳糖不存在、葡萄糖存在时，S2启动，组成型合成二、阿拉伯糖操纵子（arabinoseoperon)araB基因、araA基因和araD,形成一个基因簇，简写为araBAD。三个基因的表达受到ara操纵子中araC基因产物AraC蛋白的调控。ara操纵子的调控特点：第一，araC表达受到AraC的自身调控。第二，AraC既是ara操纵子的正调节蛋白，又是其负调节蛋白。这种双重功能是通过AraC蛋白的两种异构体来实现的（Pi和Pr)。第三，AraC与CAP结合可充分诱导ara操纵子。

与araBAD相邻的是一个复合的启动子区域和一个调节基因araC，这个AraC蛋白同时显示正、负调节因子的功能。AraBAD和araC基因的转录是分别在两条链上以相反的方向进行的。在标准的遗传学图谱上，araBAD基因簇从启动子PBAD开始向左进行转录，而araC基因则是从Pc向右转录。高葡萄糖，低阿拉伯糖有阿拉伯糖，无葡萄糖无araC蛋白时AraC蛋白作为PBAD活性正、负调节因子的双重功能是通过该蛋白的两种异构体来实现的。Pr是起阻遏作用的形式，可以与现在尚未鉴定的类操纵区位点相结合，而Pi是起诱导作用的形式，它通过与PBAD启动子结合进行调节。在没有阿拉伯糖时，Pr形式占优势；一旦有阿拉伯糖存在，它就能够与AraC蛋白结合，使平衡趋向于Pi形式。这样，阿拉伯糖的诱导作用就可以解释为阿拉伯糖与Pr的结合，使Pr离开它的结合位点，然后，产生大量的Pi，并与启动子结合。培养基中含有葡萄糖，没有阿拉伯糖：cAMP-CAP没有与操纵区位点相结合，AraC蛋白处于Pr形式并与A位点结合，RNA聚合酶很少再与Pc结合，araC基因虽然仍有转录，但受到抑制，只有少量AraC蛋白形成，整个系统几乎处于静止状态。没有葡萄糖，也没有阿拉伯糖：因为没有诱导物，尽管有cAMP-CAP与操纵区位点相结合，AraC蛋白仍以Pr形式为主，无法与操纵区B位点相结合，无araBADmRNA转录。无葡萄糖，有阿拉伯糖时：大量araC基因产物以Pi形式存在，并分别与操纵区B、A位点相结合，在cAMP-CAP的共同作用下，araC和araBAD基因大量表达，操纵子充分激活。A位点B位点araC的表达受到自身产物AraC的自动调控。当没有阿拉伯糖时，AraC起着一个转录阻遏物的作用。细胞中AraC蛋白质稳态水平的测量表明，阻遏araC转录大约需要40个AraC。因此当AraC蛋白水平低时（就是说在细胞刚分裂之后），araC将表达直至存在足够的AraC去阻遏它的转录。阿拉伯糖作为E.Coli的碳源，可以诱导ara操纵子的转录。当细胞中葡萄糖水平高（导致cAMP处于低浓度）和阿拉伯糖水平低时，AraC阻遏araB，araA，araD的转录。然而当阿拉伯糖水平高，而葡萄糖水平低（cAMP高）时，CAP-cAMP复合物能够与ara操纵子中的CAP结合部位结合，使DNA环打开。

阿拉伯糖的作用象AraC的一个调控器，可将AraC由一个阻遏物转换为一个激活剂。阿拉伯糖与AraC结合似乎改变了AraC同源二聚体化特性和促进了AraC-CAP复合物的形成。在这样的条件下，AraC－阿拉伯糖的作用象是一个转录激活剂，这正是CAP-cAMP诱导araB，araA，araD转录所需要的。

当由于araBAD编码的蛋白质的代谢使得阿拉伯糖水平下降时，AraC又转换成一个阻遏物，同时araBAD转录减少，此时尽管CAP-cAMP复合物仍然存在于细胞中。有趣的是，当葡萄糖和阿拉伯糖都很丰富时，ara操纵子被阻遏，但阻遏的道理现在还不完全清楚，但这个结果表明