利用小分子DNA鉴定重金属离子对DNA的损伤

利用小分子DNA鉴定重金属离子对DNA的损伤梅运军;张磊;毕欢;谢炳辉;朱玉婵【摘要】［Objective］TheaimwastoestablishaconvenientandeffectivemethodtoevaluatethetoxicityofheavymetalionsbyusingsmallmolecularDNA.［Method］pUC18DNAwhichhadexposedtothefourheavymetalionsofHg2+,Cr6+,Pb2+,Cd2+wasusedtostudythebioactivityofDNA;simultaneously,gelelectrophoresisandhyperchromiceffectwereemployedtodetectthemechanismofDNAdamage.［Result］ThebioactivityoftheexposedDNAwasdecreasedandtheinfluencedegreewasHg2+>Cr2+>Pb2+>Cd2+;thegelelectrophoresisandhyperehromieeffectprovedthemainreasonleadingtoreducethebioactivitywasDNAcrosslink,theorderwasHg2+>Cr6+>Pb2+>Cd2+.［Conclusion］ThestudyindicatedthatpUC18DNAcouldbeusedtoassaythedamageofDNAcausingbyheavymentalions,whichmaybeapotential,simpleandeffectivetooltoevaluatetoxicityofheavymetalionstoDNA.%［目的］利用小分子DNA鉴定重金属离子对DNA的损伤.［方法］将pUC18DNA分子暴露于Hg2+、Cr6+、pb2+、Cd2+4种重金属离子环境中，经—定时间处理后对DNA分子进行生物活性研究，并用凝胶电泳和增色效应分析了重金属离子对分子生物活性影响机制.［结果］DNA活性分析表明,4种重金属对pUC18的影响程度为Hg2+>Cr6+>pb2+>Cd2+;凝胶电泳和增色效应结果表明,4种重金属离子主要是引起DNA分子交联导致其分子生物活性的降低，交联程度为Hg2+>Cr6+>Pb2+>Cd2+.［结论］该研究表明,pUC18DNA分子可用作鉴定重金属离子对DNA损伤的依据，为评价重金属对DNA毒害作用提供了一种简捷有效的技术方法.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷)，期】2012(000)006【总页数】3页(P3258-3259,3273)【关键词】重金属离子;DNA损伤;pUC18【作者】梅运军;张磊;毕欢;谢炳辉;朱玉婵【作者单位】武汉工业学院化学与环境工程学院，湖北武汉430023;武汉工业学院化学与环境工程学院，湖北武汉430023;武汉工业学院化学与环境工程学院，湖北武汉430023;武汉工业学院化学与环境工程学院，湖北武汉430023;武汉工业学院化学与环境工程学院，湖北武汉430023【正文语种】中文【中图分类】X835重金属污染在环境污染中占有很大比例，在我国，每年因土壤污染而造成农业方面的直接经济损失达200多亿。引起环境污染的重金属主要包括Hg、Cd、Pb、Cr、Zn、Cu、Ni、Co、As等元素，大量研究证实这些重金属对动植物具有毒性［1］。但有些重金属是生物体正常生长和代谢必需的微量元素，如Zn至少是150种酶的重要组成部分［2-4］;Cd被发现在植物酶活性中起着重要的作用［5-6］;大部分重金属并非生物体生命活动所必需，超过一定浓度会对细胞有不同程度的毒害。许多重金属特别是重金属离子会对细胞的DNA造成损伤，如引起DNA链断裂、DNA与蛋白质、DNA与DNA交联。在以往的研究中通常采用动植物个体培养法或细胞培养法结合彗星电泳技术分析重金属的DNA遗传毒性［7-10］，该方法费时且操作复杂，而且由于个体间存在差异易导致结果不稳定。该研究以1种分子量较小的、具有生物活性的质粒DNA(pUC18)作为对象，探讨了4种重金属离子(Hg2+、Cr6+、Pb2+、Cd2+)对DNA分子的损伤及其机理，为研究重金属对细胞DNA的毒害提供了一种简捷有效的评价手段。1.1.1菌株及质粒。pUC18购自TaKaRa公司;大肠杆菌(Escherichiacoli)HB101(Amps)，由武汉工业学院化学与环境工程学院保藏提供。1.1.2试剂。质粒纯化试剂盒购自Promega公司;蛋白腺、酵母粉购自OXOID公司氨苄青霉素(1g)购于华北制药r；NaCl购于国药集团化学试剂有限公司;CdCl2购于北京益利化工公司;HgCl2购于贵州市铜仁化学试剂厂；Pb(NO3)2购于天津市凯通化学试剂有限公司;K2Cr2O7购于天津华东试剂厂，均为分析纯。以上重金属盐均配制成1g/L的母液，于121°C下灭菌20min待用。1.1.3培养基。LB液体培养基(g/L):胰蛋白腺10g，酵母提取物5g,NaCl5g,ddH2O1L调节pH至7.2,121C下灭菌20min;固体选择性培养基:将上述LB液体培养基中添加琼脂粉15g,灭菌，待冷却至50C左右加入氨苄青霉素(终浓度100pg/ml)o1.2.1重金属对质粒的处理。将上述配制好的重金属盐溶液用微量移液器各取300pl分别加入到对应的4个无菌的5mlEppendorf(EP)管中，再加入2.7ml无菌水，此时EP管中重金属离子的终浓度均为100mg/L,对照EP管中只加入3ml无菌水;向上述各溶液中分别加入pUC18质粒，至终浓度为1ng/pl,室温下(24.5C)静置。分别间隔8、32、56、80和104h后取样分析质粒pUC18的转化活性。1.2.2质粒纯化。按照试剂盒操作说明进行质粒纯化。1.2.3大肠杆菌转化及DNA电泳。各取1pl经纯化后的DNA样品进行DNA转化，并对菌落进行计数。大肠杆菌感受态细胞的制备、质粒DNA转化及DNA电泳参照分子克隆实验指南［11］。1.2.4DNA增色效应测定及计算。取经4种重金属离子处理6、30、54和78h的DNA分子各2份，1份在70°C的水浴上加热，另一份置于室温（24.5°C）,30min后分别在紫外分光光度计上测A260nm。以增色效应=［（A260,70C-A260,24.5C）/A260,24.5C］x100%作为DNA作为指DNA增色效应指标，研究重金属引起的DNA交联［7］。2.1重金属对DNA转化活性的影响重金属对DNA转化活性的影响程度如表1所示（均为3个平行样的平均值），与对照组相比，各重金属处理对DNA分子的转化活性具有明显的影响;对于同一种重金属而言，随处理时间的延长DNA分子生物活性逐渐减弱甚至丧失，除Cd2+外，其他几种重金属对DNA分子处理80h后生物活性完全丧失;而对于不同的重金属离子，其对DNA分子生物活性的影响也有非常明显的区别，存在如下关系Hg2+>Cr6+>Pb2+>Cd2+。导致DNA分子转化活性丧失主要有2方面的原因:由于重金属离子与DNA分子间的相互作用，致使DNA链内及链间形成了交联，转化后由于交联的DNA分子不能在宿主内复制和正常表达，故不能形成转化子;在这些可变价金属离子的作用下DNA分子发生氧化一还原反应而降解，因此也不能得到转化子。2.2凝胶电泳分析DNA分子的损伤通过质粒DNA的转化试验可以清楚的得出重金属处理的DNA分子生物活性明显降低，表明这些重金属对DNA具有明显的损伤，特别是Hg2+、Cr6+、Pb2+。为进一步探究引起DNA生物活性变化的原因，即经重金属处理的样中DNA分子是否出现断链、链间交联或降解，笔者对处理样进行了DNA凝胶电泳分析。分子生物学中，常用DNA凝胶电泳来鉴定DNA分子大小及分子构型。正是利用该原理DNA凝胶电泳也常被用于环境科学中定性分析受理化因素引起的DNA损伤，如断链或链间交联。在电泳过程中，断链或链间交联的DNA分子由于分子量或构型发生了改变，其电泳迁移率较正常DNA小，在正常DNA的电泳位置后出现弥散的条带;若DNA发生了降解，则降解后的小片段DNA较正常DNA分子迁移率快，在正常的DNA带前方有弥散的条带。因此，可以利用DNA分子在凝胶中的电泳情况判断DNA分子的损伤类型。由图1可知，除对照组外其他处理样都不同程度的出现了拖尾现象，即在正常DNA条带的后方出现了弥散的DNA，表明经重金属处理后的DNA产生了交联或断裂，未见重金属引起的DNA降解现象。该结果证实了重金属引起DNA生物活性降低甚至丧失的主要原因在于其导致DNA分子内或分子间形成了交联，也可能引起分子断链。2.3重金属处理对DNA分子交联的影响由表2可知，对照样在整个过程中，在260nm处的吸光度未见明显变化，表明其DNA数量及构型都未发生明显改变;而重金属处理组样品随着处理时间延长其吸光值都有一定程度的减少，表明DNA分子数量或构型发生了变化，结合电泳结果可知，经重金属处理后的DNA形成了分子交联。根据表2数据计算各重金属处理样增色效应情况（表3）。表3结果显示，对照样中DNA增色效应最明显，而不同时间段取样未见明显区别，表明整个过程中DNA分子未发生明显的变化;其他几种金属增色效应与对照相比都有不同程度的降低，表明了在这些金属离子的作用下DNA分子发生了交联，其影响程度大小为Hg2+>Cr6+>Pb2+>Cd2+。该结果与重金属对DNA分子转化活性影响效果一致。重金属是一类重要的环境污染物，即使在很低浓度时也对大多数生物有显著的遗传毒性。而在毒性检测及毒理分析过程中主要采用生物个体培养法或细胞培养法来分析重金属对DNA的毒害作用的（致突变、致畸、致癌），由于生物个体或细胞的差异导致各种重金属对DNA的毒害效应存在很大差异，因而不能准确评价其对DNA的毒害作用。该研究结果表明4种重金属离子对DNA具有不同程度的损伤，部分甚至完全弓|起DNA生物活性的丧失，其影响程度大小为Hg2+>Cr6+>Pb2+>Cd2+洞时，利用DNA凝胶电泳试验直观的反映了引起DNA生物活性丧失的原因，主要是DNA分子内或分子间形成了交联结构；DNA增色效应试验也进一步证实引起活性丧失是DNA分子形成了交联，通过对增色效应影响程度分析发现4种重金属离子对DNA影响程度存在如下关系:Hg2+>Cr6+>Pb2+>Cd2+。鉴于此，该试验为利用小分子DNA分析重金属离子对DNA的影响或评价环境中重金属离子对DNA的毒害提供了一种潜在的简捷、高效的分析手段。但该方法也存在一定的缺陷，如不能检测到DNA点突变。【相关文献】[1]SHARMASS,DIETZKJ.Thesignificanceofaminoacidsandaminoacid-derivedmoleculesinplantresponsesandadaptationtoheavymetalstress[J].JExpBot,2006,57(4):711-726.[2]SUZUKIT,ISHIHARAK,MIGAKIH,etal.Zinctransporters,ZnT5andZnT7,arerequiredfortheactivationofalkalineph,zinc-requiringenzymesthatareglycosylphosphatidyl-inositol-anchoredtothecytoplasmicmembrane[J].JBiolChem,2005,280(1):637-643.[3]NISHIDAK,HASEGAWAA,NAKAES,etal.ZinctransporterZnt5/Slc30a5isrequiredforthemastcell-mediateddelayer-typeallergicreactionbutnottheimmediate-typereaction[J].JExpMed,2009,206(6):1351-1364.[4]BROADLEYMR,WHITEPJ,HAMMONDJP,etal.Zincinplants[J].NewPhytol,2007,173(4):677-702.[5]LANETW,SAITOMA,GEORGEGN,etal.Biochemistry:Acadmiumenzymefrommarinediatom[J].Nature,2005,435(7038):42.[6]WALDRONKJ,RUTHERFORDJC,FORDD,etal.Metalloproteinsandmetalsensing[J].Nature,2009,460(7257):823-830.[7]葛