烤烟组织培养常见问题分析

烤烟组织培养常见问题分析

放牧通常是性繁殖的。然而，由于易受刺激和质量退化，各种疾病可能会影响经济收入。组织培养可以保持烟草品种的优良性状，减少病虫害，从而达到高产优质的目的。近年来，在烤烟及烤烟变异株的繁育上，组培技术发挥了积极作用。谢庆华等从五种培养基中筛选出最佳配方，探索利用烤烟组织培养来提供市场所需的大量种苗;彭剑涛等利用组织培养技术，筛选获得烟草抗性材料;谢丽琼等则对植物组织培养常用培养基有机组分进行了失效分析。虽然植物组织培养的操作过程并不复杂，但一些技术环节要求却十分严格，若出现一些技术细节失误，就会使试验无法进行下去，甚至导致整个试验的失败。目前，关于烟草组织培养的报道已非常多，主要集中在组培外植体选择及植物激素配比等方面。本文根据烤烟组培过程中出现的问题，结合文献，对烤烟组培过程中常见问题与引发原因进行了分析，旨在为烤烟组培快繁提供一些参考依据。1植物组织培养技术植物组织培养技术是依据植物细胞全能性及植物的再生作用，通过无菌操作分离植物体的一部分，接种到培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其产生完整植株的过程。随着研究领域的不断拓展，植物组织培养技术从最初的无性繁殖逐步渗透到植物生理学、病理学、遗传学、育种学以及生物化学等各个领域，成为生物学科中重要研究技术和手段。在植物脱毒及快速繁殖、单倍体育种、突变育种、体细胞杂交育种、工厂化育苗、药用植物开发与种子资源保存等方面具有重要的应用前景。烤烟是我国烟草生产的重要组成部分，对于改善烟区经济和农村基础设施建设发挥着重要的作用。同时，烟草还是典型的基因工程模式植物，在科学研究方面发挥着重要作用。近年来，人们在烟草的组织培养中已取得了很大的突破，相关报道层出不穷，这为烟草的快速繁殖，产业化应用与推广等提供了有利的基础条件。2家蚕组的污染与控制2.1污染的表现及危害烤烟组织培养污染源包括内因污染和外因污染。内因污染指由于外植体的表面消毒或者内部带菌而引起的污染;外因污染则是由环境污染和操作不当引起，主要是在接种或培养过程中病菌入侵。相比而言，内因污染比外因污染更难控制，特别是外植体内部带菌，表面消毒剂的作用效果不明显。造成污染的病原主要为细菌、真菌和内源菌，从微生物种类上可分为真菌污染和细菌污染，并常表现为复合污染。真菌污染表现为霉菌污染，是由于超净工作台等操作环境不清洁及操作不当等引起;细菌污染则表现为白色、透明色或有色的脓状物，常由于外植体带菌、灭菌不彻底或操作不慎造成;内源菌污染则可能表现出前两者的症状，常由于外植体材料内部的微生物(真菌、细菌)不能被一般的表面消毒方法清除而引起(图1)。2.2外植体自身带菌的控制烤烟组织培养中污染产生的原因，应从外植体消毒和无菌操作两方面来改善。控制外植体自身带菌，可通过一系列消毒处理来减少或控制;至于内源菌污染的外植体，可通过外植体的预培养来控制;通过无菌操作来提供对无菌的环境条件。2.2.1消毒方法的确定尽量选用无菌的外植体材料，以减少外植体自身带菌的影响。利用一些消毒剂，如5%～10%的漂白粉、75%酒精、0.1%升汞、2%～10%次氯酸钠和10%过氧化氢等杀死外植体表面的各种微生物。根据不同材料选用不同的消毒剂及其适宜的浓度和处理时间，运用不同的消毒方法。本研究采用10%过氧化氢作为消毒剂，8min消毒时间能够取得很好的消毒效果;同时，在外植体消毒的最后环节，将消毒过的外植体在抗生素溶液中浸泡2～3min，对于减少组培过程中的污染也具有良好的效果。2.2.2外植体消毒操作操作人员要严格遵守无菌操作规程，减少或避免培养材料和培养基的污染。操作人员在进入接种室前，要换上消过毒的工作服、鞋帽和口罩，并戴上无菌乳胶手套;操作前，超净工作台要用紫外灯杀菌8～10min，操作人员要用75%酒精擦洗双手，操作中也要间歇性擦洗;每次操作结束之后，剪刀、镊子、手术刀等工具都要灼烧灭菌。经过消毒后的外植体接种于培养基中进行无菌培养，要注意培养箱的无菌控制，打开培养箱要轻开轻闭，避免大的空气流通;另外，在培养基中加入适宜浓度的抗生素，如青霉素、链霉素、土霉素、头孢霉素等细菌、真菌抗生素，也能够较好地抑制杂菌的污染。3种植和玻璃控制3.1组培苗玻璃化原因分析植物组织培养中，常可以见到一些半透明状的畸形试管苗，这类植物体被称为玻璃苗，这种现象被称为玻璃化现象(图2)。发生玻璃化的组培苗，其组织结构和生理功能异常，分化能力低下，玻璃化已成为组织培养工作中的一大难题。导致玻璃化的因素很多，不同植物玻璃化诱发因素往往不同，引起烤烟组织培养的玻璃化现象的原因可能有:在培养过程中的光照、温度、湿度和pH值等条件与适生环境差别较大;烤烟外植体部位、类型、素质等诱导玻璃苗的发生;培养基的成分如Ca,N,Mn,Fe,B,Zn含量低等。3.2组培材料的改进减少烤烟组织培养过程中的玻璃化现象，可以通过合理选择外植体类型，优化、调控培养基配方，为不同阶段的培养物提供适宜的生长环境。一是合理选择烤烟组培外植体的类型。烤烟组培常用的外植体有茎段、茎尖、幼嫩叶片和根尖等，一般幼嫩叶片和茎尖组织可以减少玻璃化。二是适当利用固体培养基，增加培养基硬度。调节培养基的pH值，提高琼脂浓度，玻璃化的比例明显下降。三是适当降低细胞分裂素的浓度，根据组培的不同阶段，合理调节细胞分裂素与生长素的比例。四是适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，降低培养基中的渗透势，减少培养基中植物材料可获得的水分。五是尽可能降低培养容器内的相对空气湿度和改善氧气供应状况，要注意薄膜的通透性或改用透气膜。4组培培养过程中培养特点黄化是指在组培过程中由于培养基成分、环境、激素、碳水化合物等各种因素引起的幼苗整株失绿，全部或部分叶片黄化、斑驳(图3)。引起烤烟组织培养过程中黄化的原因主要有:培养基中Fe的含量不足;各种矿质营养不均衡;培养环境通气不良，瓶内乙烯含量升高;激素配比不当;糖用量不足或长时间不转移致使糖已耗尽;pH值变化过大;培养温度不适;光照不足等。减少烤烟组织培养过程中黄化的关键，在于调节培养基中成分与含量，改善组培环境，主要有:在配制母液和培养基的制作过程中，对培养基的每一个化学成分都要