烟草细胞悬浮培养体系的建立

烟草细胞悬浮培养体系的建立

集体培训不仅是快速植物育种的一种手段，也是植物改良、物种保存和二次材料生产的一种理想方式。有关烟草组织和细胞培养已有不少报道,近年来在抗性研究、基因转化和次生物质生产等方面也取得一些进展。有研究表明,以植物悬浮培养细胞为材料生产次生代谢物具有培养周期短、材料均一、重复性好等优点。烟草中含有大量次生代谢物,因此,建立稳定而具有高活力的烟草悬浮培养细胞体系对次生代谢物的生产有重要意义。到目前在白肋烟的愈伤组织培养和细胞悬浮培养方面的研究报道较少。本试验以白肋烟鄂烟1号的叶为材料进行了愈伤组织的诱导,确定获得脆散性愈伤组织的最佳激素配比,并以此为基础建立起烟草细胞悬浮培养体系,旨在为烟草中次生物质的生物开发利用提供依据。1材料和方法1.1试验材料鄂烟1号烟草种子,由郑州烟草研究院提供。1.2测试方法1.2.1种子幼苗的制备将烟草种子用70%酒精浸泡1min,10%NaClO消毒10min,经无菌水漂洗后接种于无激素的MS固体培养基,28℃下暗培养,之后将未污染的发芽种子转接到MS0固体培养基上,于28℃下光照培养16h,得无菌种子幼苗。1.2.2加有激素的基本培养基取无菌苗叶片外植体,切成5mm×5mm的小块,接种在加有激素的3种基本培养基上,各处理见表1。28℃下暗培养,15d后得到初始愈伤组织。1.2.3培养叶片的激素配比在基本培养基筛选的基础上,筛选出最优基本培养基为MS培养基,其对激素配比做进一步的调整细化,见表2,选取长势较好的愈伤组织继代培养,筛选最佳生长培养基。1.2.4脆散性损伤按已确定的生长培养基配方配制固体生长培养基,选择长势较好、黄白色的愈伤组织进行继代,28℃下暗培养,第4代后获得脆散性愈伤组织。1.2.5愈伤组织的生物干重百分率测定按已确定的最优生长培养基配方配制固体培养基,灭菌分装于三角瓶中。将切好的脆散性愈伤组织称重后接种于编号的三角瓶中,记录m1;于28℃下暗培养,每2d取样1次,每次取样3瓶,称取愈伤组织鲜重,记录m2;将愈伤组织烘干至恒重,称重记录m3。每次取样的愈伤组织鲜重与干重倍增值的计算方法:愈伤组织鲜重倍增值F=m2/m1愈伤组织干重倍增值D=m3/(m1·1.5%)式中:1.5%为接种愈伤组织的生物干重百分率。依据愈伤组织鲜重与干重倍增值的平均值绘制生长曲线。1.2.6犯罪人员的培养按已确定的生长培养基配方配制液体生长培养基,将疏松愈伤组织用玻璃棒碾碎,每瓶加入一定量的愈伤组织,pH值为5.7~5.8,28℃下摇床暗培养,摇床转速110rpm。2结果与讨论2.1愈伤组织的诱导将烟草外植体接种到基本培养基上,28℃下暗培养15d,观察外植体生长分化的情况,获得一系列不同分化程度的烟草愈伤组织,见表3。由表3可见,3种基本培养基中激素组合NAA+6-BA的烟草愈伤组织诱导率优于2,4-D+KT,NT基本培养基上烟草愈伤组织的诱导率很低。MS培养基的各种处理诱导出愈伤组织最快,约6~8d;B5基本培养基约为10~12d;在NT基本培养基上的诱导时间较长,约35~40d,而且外植体的死亡率也比MS和B5基本培养基高。因此NT培养基不适合本实验材料愈伤组织的诱导。在MS培养基和B5培养基上,加2,4-D激素虽然有抑制芽分化的作用,但是浓度高于1.0mg/L时会使愈伤组织变黑,对细胞生长不利。MS培养基上,MS3(NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L)的效果最好,烟草胚性愈伤组织的诱导率较高,没有褐化,MS4(NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L)次之,MS1(2,4-D3.0mg/L+KT0.2mg/L)褐化严重;B5基本培养基上,B53(NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L)的效果最好,B54(NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L)次之。可见,3种培养基中MS基本培养基适合本实验材料外植体的诱导。2.2培养基配方的筛选在基本培养基中选择烟草细胞脱分化程度高、生长快的培养基配方MS+NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L、MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L和MS+2,4-D1.0mg/L+KT0.5mg/L,以此为基础对激素配比作进一步的调整(表2),选择长势较好,淡黄色的愈伤组织切成小块,接种到新鲜的培养基上。28℃下暗培养15d,观察结果见表4。由表4可以看出:2,4-D和KT组合中,KT浓度一定时,2,4-D比例越大,愈伤组织褐化有加重的趋势;2,4-D一定时,KT比例越大,愈伤组织分化程度越高。并且该组合愈伤组织生长较慢,体积较小。NAA和6-BA组合中,愈伤组织褐化不明显,在一定浓度范围内,NAA有利于愈伤组织的生长,可一定程度地抑制愈伤组织分化;在一定的NAA浓度下,6-BA比例增大,愈伤组织分化程度加重。总体来看,培养基配方中以MS26即MS+2,4-D0.1mg/L+NAA1.5mg/L+6-BA0.3mg/L的配比最佳,在该培养基上的愈伤组织生长快、疏松程度较好、脱分化程度较高。该培养基可作为建立细胞悬浮系的生长培养基。这与刘卫群报导的MS+2,4-D2mg/L+6-BA0.5mg/L烟草愈伤组织诱导效果最好和MS+NAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L、MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/L愈伤组织生长最快不一致,可能是由于烟草品种和培养条件的不同所致。2.3培养基间愈伤组织生长以MS+2,4-D0.1mg/L+NAA1.5mg/L+6-BA0.3mg/L配方配制固体培养基,选择长势较好、淡黄色的愈伤组织切成小块接种培养,每2d取样1次,称鲜重和干重。以愈伤组织鲜重、干重生长倍增值的平均值为纵坐标,取样时间为横坐标绘图(图1)。由图1可见,在MS24(MS+2,4-D0.1mg/L+NAA1.5mg/L+6-BA0.3mg/L)培养基上愈伤组织生长快,第6d起开始快速生长,14d时鲜重增至接种时鲜重的13.269倍,干重增重12.536倍,达到最高,16d时有所下降,需要更换培养基再次继代。该培养基可作为建立细胞悬浮系的生长培养基。2.4悬浮系的生长按已确定的最优配方即MS+2,4-D0.1mg/L+NAA1.5mg/L+6-BA0.3mg/L制备液体生长培养基,在接种量10%、蔗糖浓度3%、水解酪蛋白浓度0.1%、pH5.8、摇床转速110rpm、28℃下暗培养,培养瓶中的悬浮系能够迅速生长。每15d继代1次,每次继代时,将培养瓶静置几分钟后,倒掉2/3原培养液,然后更换新培养瓶,加入新的培养液。连续继代4代后,愈伤组织建立的细胞悬浮系生长迅速,颜色淡黄、分散性和均一性均较好,且能够较长期保存,可作为次生代谢物生产的培养体系。3-ba工艺参数对愈伤组织生长的影响白肋烟鄂烟1号愈伤组织诱导的3种基本培养基中,MS培养基优于B5培养基,而NT培养基不适合鄂烟1号愈伤组织的诱导。