五子衍宗丸对无精子小鼠睾丸内生精细胞因表达的影响

五子衍宗丸对无精子小鼠睾丸内生精细胞因表达的影响

唐五子衍宗丸是中学思想的经典方剂，具有补肾益精的功效。这是治疗男性不育和提高精子质量的常用方剂。临床医学中使用的大量有效方剂通常是基于此。对补肾生精药物的研究,多集中在临床疗效的评价方面,缺少相关作用机制方面的基础研究认识。我们在前期的研究工作中发现,五子衍宗丸具有保护、促进诱导睾丸生精干细胞分化并提高精液质量的明显作用。在利用基因芯片技术对五子衍宗丸促进生精过程的作用机制研究中,发现睾丸全基因表达谱中的有关免疫系统具有特殊表现,五子衍宗丸可能通过促进机体免疫功能进而刺激生精细胞,从而使生精能力恢复和增强。现将结果报告如下。1材料和方法1.1实验动物及饲养无特定病原菌SPF三级成年12周龄NIH雄性小鼠,25只,购自北京市维通利华实验动物技术有限公司,合格证号:SCXK(京)2009-2009,自由进食常规饲养。1.2糖原和ambion试剂五子衍宗丸(北京同仁堂,批号4030124),白消安(Sigma公司),二甲基亚砜(DMSO,Axygen公司),TRIzol试剂盒、无RNA酶的糖原(InvitrogenLifeTechnologies公司),AmbionMessageAMPaRNA试剂盒(Ambion公司),NucAway柱(Ambion公司)。MouseOneArrayTM芯片(Phalax公司),该芯片以小鼠外显子寡核苷酸(MouseExonicEvidenceBasedOligonucleotide,MEEBO)设计为基础,每芯片上有29922个小鼠基因探针以及1800个实验探针。1.3造模成功小鼠取15只小鼠按白消安诱导常规方法制备无精子症动物模型:白消安溶解于DMSO中配制成2%药液,40mg/kg单次腹腔内注射给药,连续观察42d(6周)。18周龄存活的10只小鼠为造模成功,给予五子衍宗丸纯净水悬液,每只含生药0.048g/d(按照成人临床5倍剂量换算),连续给药78d(2个小鼠生精周期)。同批次未造模小鼠10只为正常对照组,每日给予纯净水。每只灌胃量均为0.2ml/d。所有动物最后一次给药后24h断脊处理,取出一侧睾丸,迅速液氮冷冻后,于-70℃冰箱中保存。五子衍宗丸组和正常对照组小鼠各选择5只用于睾丸全基因表达谱研究。1.4合成cdna睾丸全基因组表达谱分析RNA样品制备按照TRIzol试剂使用说明书操作,提取小鼠睾丸组织总RNA,变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性,合成cDNA第1链、第2链。双链cRNA产物纯化后,用aa-UTPaRNA对双链cRNA进行间接标记,经过预杂交、杂交和洗片后对结果进行扫描并读取数据。1.5mox给药与药物基因筛选的数据分析以2组间上调或下调2倍以上为有意义的差异基因。差异表达基因分析、芯片数据的统计学分析、聚类分析采用MouseOneArray(○R)AnnotationMOA2(小鼠表达芯片)release2.0软件。在网站中,对差异表达2倍以上的基因进行KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,京都基因与基因组百科全书)富集分析。2结果2.1小鼠基因表达的现状通过计算机扫描和定量分析,五子衍宗丸组与正常对照组小鼠比较,在检测的31722个基因中,基因表达具有2倍以上明显差异的上调基因355个(占1.12%),下调基因487个(占1.54%)。见表1、表2。2.2聚类分析的结果部分聚类分析结果见图1。2.3小鼠海马糖凝胶电泳的优化对这些差异基因进行信号通路分析显示,差异基因主要表现在黏附功能、细胞周期、细胞因子-细胞因子受体作用、Hedgehog信号通路、Jak-Stat信号通路、Mapk信号通路、Notch信号通路、Toll样受体信号通路、Wnt信号通路和FcepsilonRI通路等方面;下调的差异基因主要集中在化学信号途径、泛素介导的蛋白水解、核糖体、胞质DNA的传感途径、白细胞跨内皮细胞迁移通路等。通过KEGG富集分析后发现,MKK4/7、MKK3/6、IL-3、TNF-α、Grb2、PLA2和P38等7个基因存在于FcepsilonRI通路中Fc段IgE受体α多肽。见图2。3fcep1基因对无精子小鼠睾丸中rap1mrna表达的影响五子衍宗丸是经典的补肾生精名方,常用于治疗肾虚证和男性不育症,而肾虚与免疫功能密切相关。虽然五子衍宗丸对正常小鼠的非特异性免疫功能有少量的增强作用,但是在使用环磷酰胺导致的免疫受抑小鼠中,五子衍宗丸可以提高单核细胞的吞噬能力,促进小鼠脾细胞生成抗体的能力。利用基因芯片技术可使我们在很短时间内大规模找到不同处理组的差异,为后续研究奠定基础。我们前期的研究结果提示,五子衍宗丸可以刺激小鼠睾丸生精上皮细胞的活化,促进生精功能的恢复。该结果与其他研究报道一致,但其分子机制不甚明了。因此我们采用小鼠基因表达谱芯片研究五子衍宗丸在无精子小鼠的生精能力恢复过程中的作用。在本实验中,通过基因芯片检测,发现服用五子衍宗丸后的无精子小鼠睾丸mRNA中355个基因上调,487个基因下调。在本课题的前期动物实验部分,通过对小鼠体质量、生殖器官组织质量和指数、附睾精子质量(活动率、活动力和浓度)等与生殖作用相关指标的分析,结果均表现出五子衍宗丸对生精能力的促进作用。与造模自然恢复组比较,五子衍宗丸组具有明显的改善,接近无损伤的正常组。因此,本实验在进行芯片分析中,未采用造模后自然恢复组作为对照,仅完成正常对照的比较分析。RAP1是原癌基因ras超家族成员之一,RAP1的表达与正常人和大鼠的精子发生相关,在无精或少精的人和大鼠的睾丸组织中RAP1表达明显降低。本实验发现,五子衍宗丸可以刺激无精子小鼠的RAP1mRNA表达增加2倍以上,提示五子衍宗丸可以促进无精子小鼠生精能力的恢复。本研究发现,在FcepsilonRI通路中的7个基因发生了明显的变化。FcepsilonRI信号通路在肥大细胞的非特异性免疫过程中对非特定的外来入侵物产生快速反应的过程中起重要作用。在此通路中,当抗原和IgE结合到FcepsilonRIα链的细胞外结构域时,在肥大细胞中由FcepsilonRI介导的信号途径被启动。激活的信号通路可以被大量的信号分子之间的相互作用所调节。肥大细胞被激活后释放出的颗粒主要是由两种生物胺(尤其是组胺)和蛋白糖苷(肝素)组成。在此过程中磷脂酶2(PLA2)的激活使膜脂中的某些成分如白三烯(LTC4、LTD4、LTE4)和前列腺素(PG2)释放,伴随着TNF-α、IL-4和IL-5等细胞因子的分泌,共同导致炎症反应发生。而我们检测到了TNF-α、IL-3、MKK4/7、MKK3/6、Grb2和PLA2、P38基因表达变化。生长因子受体结合蛋白(Grb2蛋白),又名Ash蛋白,可直接结合激活的表皮生长因子受体,参与表皮生长因子受体介导的信号转导,也可与酪氨酸结合间接参与由胰岛素受体介导的信号转导。一旦Grb2的功能受到抑制,很多器官的发育过程均会受到不同程度的损害。TNF-α是一种刺激急性期反应、参与系统炎症反应的细胞因子,可诱导细胞凋亡、产生炎症反应,抑制肿瘤增殖和血管再生。TNF-α可以在精子发生的不同阶段表达,当TNF-α浓度过高时,可以抑制精子发生,从而引起男性不育。本实验发现,服用五子衍宗丸的无精子小鼠TNF-α的表达降低,提示五子衍宗丸对生精能力的恢复作用可能通过两个方面实现:一方面可能通过改善睾丸中的免疫环境,另一方面可能通过降低TNF-α的对生精过程中的毒性发挥功能。IL-3又称为多重集落刺激因子(multi-CSF),不仅可以刺激多能干细胞和多种祖细胞的增殖与分化,也可以促进多能髓样祖细胞向红样、巨核、单核、中性、嗜酸和嗜碱粒细胞活化。最近还发现IL-3可以阻止肥大细胞发生程序性细胞死亡。在人和牛的睾丸中,IL-3通过增加己糖的摄入改善睾丸内免疫细胞的活性,提高生殖细胞的增殖能力。PLA2分子能够促进细胞非分化性增殖。PLA2可以刺激顶体的胞吐作用,调节生殖细胞的生长和分化,进而调节生精过程。P38又叫RK,是酵母Hoglp有丝分裂酶原激酶在哺乳动物中的同源物。该激酶是一系列的有丝分裂原激活的蛋白激酶。当细胞在压力刺激如细胞因子、紫外照射、热激和渗透压改变时,该激酶系统启动并通过级联信号放大系统调控细胞的反应。在人工诱导的隐睾模型中,P38和(TGF)β2andβ3表达降低导致血睾屏障中的紧密连接不可逆的破坏,导致少精弱精症的发生。本实验的结果与上述报道一致。MAPK(mitogenactivatedproteinkinase4,丝裂酶原活化蛋白激酶4)的激酶有MKK4(MAPK激酶4)和MKK7。MKK4和MKK7与JNK(氨基末端激酶c-jun)结合形成一个信号复合体,然后再与IL-1结合迁移到细胞核内,使该复合体活化。因此,MKK4和MKK7是JNK通路中的关键调节因子。MKK3和MKK6通过与远距离外的MKK相关的酪氨酸和苏氨酸处磷酸化激活P38MAPK,从而选择性地提高P38MAPK的活性。本研究发现,FcepsilonRI信号通路中的几个基因的表达有明显的差异,其中TNF-α、IL-3和Grb2三个基因是经典的机体参与免疫反应的相关基因,而MKK4/7、MKK3/6、PLA2和P38除了在FcepsilonRI通路中参与机体免疫反应外,也是MAPK