食品快速检测方法-分子生物学快速检测技术

荧光定量PCR原理基本概念一数学原理二目录页定量原理二

1.扩增曲线2.荧光阈值3.Ct值一基本概念激发光发射光--在PCR反应体系中加入荧光基团。--荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。--利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。

荧光基团荧光定量PCR

1.扩增曲线（primarycurve）扩增曲线：随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。纵坐标：Rn（荧光值）横坐标：cyclenumber（循环数）线性图对数图

2.荧光阈值（threshold）基线(baseline)：一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信号荧光阀值(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值--缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍--手动设置：大于样本的荧光背景值

3.Ct

值(CycleThreshold)Ct值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，荧光值所对应的PCR循环次数。起始模板量基线阈值Ct值、

Ct

值(CycleThreshold)Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动很大，但Ct值相对固定；Ct值则极具重现性

二数学原理理想的PCR反应：

N=N0*2n实际的PCR反应：

N=N0*(1+E)nN0：初始模板量N：第n次循环后的产物量n：扩增反应的循环次数

E：扩增效率

同一个样本进行96次重复传统PCR检测RealtimePCR检测RealtimePCR--起点检测：--起点量是样本中起始的DNA量--“加入了500个拷贝”--具有重现性，误差小传统PCR--终点检测：--终点产物量经过PCR放大的DNA量--“生成了500，0000，0000个拷贝”--不恒定，误差大传统PCR检测在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0

(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0

(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:

logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量

1.绝对定量2.相对定量三定量原理扩增曲线标准曲线.未知10410310610510210我们可以看到模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线1.绝对定量确定未知样品的C(t)值通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample25

2.相对定量参照样本Calibrator用于比较结果的基准。特点选择内参基因内参基因beta-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因housekeepinggene在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小--文献检索--实验筛选内参基因--同样体积或重量的样本所来源的细胞数目不同。--RNA抽提、反转效率不同，操作中存在误差。对样本初始浓度差异进行均一化校正。成立条件：假设扩增效率为100%满足条件：1）内参基因和目标基因的扩增效率接近2）内参基因和目标基因的扩增效率均为90%-110%假设条件：内参基因和目标基因扩增效率差异大于5%1）优化实验条件，使扩增效率接近2）使用其他方法(1)2-ΔΔCt法

待测样品目的基因浓度待测样品内参基因浓度

F=对照样品目的基因浓度

对照样品内参基因浓度假设条件：内参基因和目标基因扩增效率不同优点：实验优化简单缺点：每一轮实验都必需做标准曲线80%(2)双标准曲线法环介导等温扩增技术原理概念一引物设计二分步原理四目录页基本原理三

环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,简称LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的BstDNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。一概念

LAMP技术扩增基因的关键是设计出4条特异性的引物，从需要扩增的靶序列中选出F3c、F2c、F1c、B1、B2、B3六个特定的区域二引物设计引物设计针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’端的F3c、F2c和Flc区以及5’端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。LAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则只有内引物被使用。FIP(ForwardInnerPrimer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。引物设计F3引物：上游外部引物(ForwardOuterPrimer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。BIP引物：下游内部引物(BackwardInnerPrimer)，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。B3引物：下游外部引物(BackwardOuterPrimer)，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。LAMP反应引物与对应模板区域

1.基本原理2.引物设计3.分步原理三基本原理1.基本原理60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物合成的DNA链取代模板互补链。①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特性的BstDNA聚合酶②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及进行温度循环。

1.起始阶段2.扩增阶段四分步原理（1）内引物FIP的F2与其模板的互补序列F2c结合，在BstDNA聚合酶作用下，从F2的3’末端开始启动DNA合成，合成一条以FIP为新的DNA单链并与模板链结合形成新的双链DNA。1.起始阶段（2）以F3为起始合成的新链与模板链形成双链。而原合成的以FIP为起始的DNA单链被置换而脱离产生一单链DNA，其在5’末端F1c和F1区发生自我碱基配对，形成茎环状结构。

1.起始阶段（3）引物BIP的B2与模板链B2c区互补配对，合成以BIP为起始的新链，并与模板链互补形成DNA双链。同时，F端的环状结构将被打开，外引物B3与模板上B3c杂交后，以其3’末端为起点也开始合成新链，并使以BIP为起始的DNA单链从模板链上脱离下来，形成以FIP和BIP为两端的单链。因为B1C与B1互补，F1C与F1互补，两端自然发生碱基配对，这条游离于液体中的DNA单链分别在F和B末端形成两个茎环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构，此结构即为LAMP的基础结构。形成LAMP基础结构1.起始阶段

第一步：以上述的哑铃结构F1的3’末端进行合成延伸，并且打开5’末端的环。第二步：以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合，开始链置换合成；同时3’末端B1c和B1区域互补，在3’末端形成茎环结构，以自身结构为模版，B1的3’端区域为起点进行DNA合成，释放出带有FIP的互补序列。第三步：上一步中形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，接着BIP引物上的B2与它们杂交，启动新一轮扩增2.扩增阶段环介导等温扩增技术（LAMP）简介等温扩增技术简介一LAMP特点二LAMP应用三目录页

1.概念2.优点3.种类4.限量值一等温扩增技术简介1.概念等温扩增技术(IsothermalAmplificationTechnology)是核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速核酸扩增的目的。与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足快速简便的需求。2.优点特异性高分析速度快成本低突变率低不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作检测核酸成分比检测微生物本身危险性小方便诊断3.种类环介导核酸等温扩增技术（LAMP）滚环扩增技术RCA单引物等温扩增SPIA依赖解旋酶的等温扩增技术HAD链替代扩增SDA交叉引物扩增技术CPA核酸依赖性扩增检测技术NASBAQβ复制酶反应各类等温扩增技术的比较温度℃引物模板其他NASBA42需要2条RNA反转录酶，RNA酶H，T7RNA聚合酶SPIA421条RNA反转录酶，T7RNA聚合酶HDA37/65需要2条DNA解旋酶，扩增片段小SDA37/65不需要DNALAMP634条DNADNA聚合酶RCA37-65需要DNAQβ37不需要RNA

LAMP技术

1.优势2.缺陷二LAMP特点1.优势LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。操作简单：只需一个水浴锅快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成

的时间损失特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。

高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。2.缺陷所识别的靶位序列长度不得过大，一般在300bp以内。因此，无法进行长片段DNA的扩增；

LAMP技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区，否则极易受到污染而产生假阳性结果；

LAMP的反应结果只有两种即扩增与不扩增，故在产生非特异性扩增时是难以进行后续鉴定的；产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克隆等基因工程操作。

三LAMP应用农业、养殖行业的致病因素检测食品安全中的病原性危险因素检测，因其快速、高通量、简便疾控系统，突发公共卫生事件的应急检测临床诊断，病原微生物的检测。尚需有药准字的试剂盒面世实时荧光核酸恒温扩增（SAT）技术简介一原理二应用三目录页

1.概念2.产生的背景3.特点一简介1.SAT的概念

实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SimultaneousAmplificationandTesting，简称SAT）是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术。

同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，然后利用T7RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（100～1000个）RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，实时反映扩增循环情况。2.产生的背景DNA和RNA的区别糖基+Base

Nucleoside+Phosphate

PNucleotideA、DNA和RNA的主要区别就在骨架上的糖基。B、DNA很稳定，RNA不稳定。2.产生的背景通常RNA在细胞中拷贝数远高于DNA的拷贝数一个或几个拷贝DNA可达10000个拷贝的核糖体RNA(rRNA)OneCellContains:2.产生的背景如使用rRNA为靶标，将极大地提高了取样效率和扩增检测灵敏度A、如果2ml样本含有1个细菌

取0.2ml样本，最终得到细菌的几率是1/10。SampleCellLysisTargetRNAReleased2.产生的背景DNA扩增技术A、PCR：使用Taq酶进行扩增，温度循环；RT-PCR将RNA变成DNA，再进行DNA扩增B、实时荧光PCR：扩增与PCR相同，采用实时闭管荧光检测（分子信标，Taqman探针等）RNA扩增技术A、TMA：恒温扩增，使用RT酶和T7酶；终点杂交保护检测B、SAT：扩增与TMA相同，采用实时闭管荧光检测（分子信标）3.特点针对靶标核酸特异设计的引物和分子信标，实现特异性的扩增和检测，有效防止假阴性结果。SAT检测的靶标核酸是RNA，而RNA在病原体外的环境中易降解，检测结果可作为区分死菌、活菌的依据，因此更利于用药之后疗效的监测和判愈。SAT技术的高灵敏度、高特异性则可以最大程度地确保检测结果的高度准确，高度可靠，有效避免假阳性、假阴性结果。3.特点与PCR、TMA等相比，SAT改进了捕获方法靶标核酸捕获核酸磁珠OligodTOligodA优点：几乎去除了所有抑制剂允许使用大体积样本可同时处理多种样本3.特点与PCR、TMA等相比，SAT开发了全自动样本处理方法全自动样本处理工作站特点不需要任何样本前处理国内唯一全自动尿样（血样等）处理系统1.5小时，96个样本（RDMag-96）样本提取反应液制备一体化

二原理SAT技术（SimultaneousAmplificationandTesting）是基于TMA（Transcriptionmediatedamplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术SAT与PCR技术原理比较

RTRNAcDNART~1000copiesT7SATDNATaqTaqPCR30分钟内扩增1010倍

CT/NG尿液检测结核分枝杆菌检测其他检测三应用1.CT/NG尿液检测CT-SAT拭子尿液NG-SAT拭子尿液CT感染拭子和尿液灵敏度对比NG感染拭子和尿液灵敏度对比2.结核分枝杆菌检测操作流程痰液预处理超声波处理15min预热15min恒温扩增40min耗时2小时3.其他应用其他科研临床检验血液筛查传染病癌症检测遗传检测HIVHCVHBVSyphilis细菌支原体CTNGUUTBMGMP病毒检测HIVHCVHBVHPVEV/EV71/CA16FluA/H1N1HCMV前列腺癌直肠癌乳腺癌巨细胞瘤其它肿瘤工业界学术研究用食品安全水污染检测环境污染检测国防生物反恐动植物检疫农业病害耐药性检测MRSAVREMDR-PAMDR-ABMDR-TBESBLs…生物芯片生物芯片简介一生物芯片分类二生物芯片技术要点三目录页

1.概念2.发展历史3.现状4.应用一生物芯片简介1.概念生物芯片是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测和分析的一项高新技术。——《生物医学测量与仪器（第二版）》（复旦大学出版社）王保华2.发展历史1988年Bains等人将短的DNA片段固定到支持物上，以反向杂交的方式进行序列测定。1998年12月Affymefrix公司和MolecularDynamics公司宣布成立基因分析协会以制定一个统一的技术平台生产更有效而价廉的设备，英国的AmershcemPharmaciaBiotechnology公司也在同一天宣布将提供部分掌握的技术以推动这项技术的应用。1996年美国Affymetrix公司成功的制作出世界上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯片，并制作出芯片系统2002年2000年开始1999年1998年10月中科院将基因芯片列为"九五"特别支持项目，利用中科院在微电子技术、生化技术、物理检测技术方面的优势，组织跨所、跨学科合作。国家科技部起草了《医药生物技术“十五”及2015年计划》，规划所列15个关键技术项目中就有8个需要使用生物芯片，并把生物芯片单独列为一个专门项目进行规划。我国陆续投入5亿元人民币（统计直至2005年），对生物芯片系统研发做倾斜性支持。世界首例用于肿瘤早期监测的生物芯片在上海问世。3.现状4.应用中药鉴定环境监测肿瘤研究、POCT4.应用

1.基因芯片2.蛋白质芯片3.芯片实验室二生物芯片分类1.基因芯片又称DNA芯片(DNAchip)或DNA微阵列(DNAmicroarray)，是将cDNA或寡核苷酸按微阵列方式固定在微型载体上制成。2.蛋白质芯片将蛋白质或抗原等一些非核酸生命物质按微阵列方式固定在微型载体上获得。芯片上的探针构成为蛋白质或芯片作用对象为蛋白质者统称为蛋白质芯片。3.芯片实验室用于生命物质的分离、检测的微型化芯片。芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。它将样品的制备、生化反应到检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统。

三生物芯片技术要点1.芯片制备由于生物反应多种多样，而不同的生物反应需要在不同的材料中进行，为了能够在芯片上完成这些反应，制作芯片的材料就必须多种多样，如硅、玻璃、塑料以及陶瓷等生物芯片与集成电路芯片有着本质区别：它处理的并不是电信号，也不具有运算功能，而是一种以生物分子为处理对象、执行生化分析检测的微型设备。不过二者还是有很密切的联系，都有集成化、微型化、可对信号进行并行