RNAi技术及其实验操作

ＲNAｉ技术及其实验操作点击次数：252发布时间：2０１０－11－1414:04:０９RNAi技术及其实验操作目前对RNＡi（ＲNAinterfeｒencｅ）的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将ＲNAｉ看作一种生物学现象,可以有以下定义：①RNＡｉ是由ｄsＲＮA介导的由特定酶参加的特异性基因缄默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。②ＲNAi是有dsRNＡ参加指导的,以外源和内源mRNA为降解目标的转基因缄默现象.具有核苷酸序列特异性的自我防御机制,是一种当外源基因导入或病毒入侵后,细胞中与转基因或入侵病毒RNＡ同源的基因发生共同基因缄默的现象.ﻫ如果将其作为一门生物技术,则定义为:①RNＡi是指通过反义RNＡ与正链RNＡ形成双链ＲNA特异性地抑制靶基因的现象，它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA和反义RＮA）,从而诱导内源靶基因的mＲNA降解,达到阻止基因表达的目的。②RＮAｉ是指体外人工合成的或体内的双链RＮA（dsＲNA)在细胞内特异性的将与之同源的mＲNA降解成２1ｎｔ～２3ｎt的小片段，使相应的基因缄默。③RNＡi是将与靶基因的mRNA同源互补的双链RNA（dｓRNA)导入细胞,能特异性地降解该mRNＡ,从而产生相应的功能表型缺失，属于转录后水平的基因缄默(poｓt-ｔraｎsｃripｔｉonalｇｅneｓileｎcｅ,ＰTＧＳ)。ﻫ各种不同定义虽然说法不同,但所描述事实是大体相同的，简洁地可以说，ＲNAi就是指由RNＡ介导的基因缄默现象。也就是说,ＲＮAi技术是利用ＲNＡi为原理，在体外利用化学或酶促合成ｓｉRNA，也可构建在体内合成sｉRNA的质粒或病毒表达载体,然后利用传统微注射磷酸钙法、电穿孔转染法、脂质体介导转染等方法转染细胞从而致使靶基因缄默的技术.RNA干扰有很多方法：①化学合成法：应用最广泛但成本昂贵，体外合成的长21ｎt、3`端带有2个游离核苷酸的siＲNA较其它形式合成的RNA具有更大效率的降解目的ｍRNＡ的效果.②siRNA表达载体:在质粒或病毒载体中，利用ＲＮA聚合酶启动因子U６或T７分别掌握正义链和反义链的合成并退火形成双链siRＮA,或在启动子下游设计带发夹结构的表达单位，自身退火形成双链siRNA。③dsRNＡ表达载体:多用于果蝇、线虫等低等生物,在体内表达后被Ｄｉcｅｒ切割成21-23nｔ的siRNA;或在体外利用Ｄiceｒ、RNaseIII切割dｓRNＡ产生ｓiRＮA，纯化后使用。ﻫ最近由于ＲＮＡ干扰（RＮAinteｒference,RNAi)的发现使反义领域的讨论增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的,是序列特异性地使转录后的基因缄默的有力机制。ＲNA干扰是由长的双链RＮＡ分子发动的,该分子可以被Ｄicｅｒeｎzｙme加工成长度为2１－２３个核苷酸的RNA。ＲNａseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA的两个链都进行切割，酶切的产物３'末端相互重叠。然后这种小的干扰RNＡ分子(smallinteｒfｅrｉnｇRＮAs，siRNAs）掺入RNA诱导的缄默复合物（RＮＡ—inｄｕｃedｓiｌｅncinｇcomplｅx，RＩSC),引导核酸酶降解靶RＮA。

这种保守的生化机制可用于讨论多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，由于长的双链RNＡ分子会引起干扰素应答。因此Ｔｕscｈi及其同事表明长度为21nｔ的siRNA可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破。这个发现激发了大量利用RＮAi技术对哺乳动物细胞的讨论,由于与传统的反义技术比,ＲNＡi的性能明显较高.ﻫ有趣的是，除了短双链ＲNA，短发夹ＲNA(shｏrtｈａｉｒpinＲＮA，shＲNＡ),比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNＡ，从而产生RＮＡ干扰。这使得构建表达干扰ＲＮA的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期缄默成为可能。shRNA可以利用ＲNA聚核酶ＩII启动子转录，在正常情况下,该启动子是掌握小核ＲNＡ（smalｌnｕclearRＮA,sｎRNA）U6或者RNａｓeＰ的组分Ｈ1ＲNA转录的.另外一种方法是两段短RNA分子分别用U６启动子转录出来。载体介导的ｓｉRNＡ表达使对功能缺失(loｓｓ—of-ｆunｃtiｏｎ)表型进行长期分析成为可能。在稳定转染的细胞内,两个月后仍可观察到缄默现象。

另外一种延长siRＮA抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RＮA进行核苷酸修饰.尽管未经修饰的短双链RＮＡ在细胞培育物或者体内的稳定性出乎意料的高,然而有些情况下，需要对siRＮＡ的稳定性进行进一步提高。因此,可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷。一个５＇端为两个2’-O－甲基RNA、３’端为４个甲基化核苷的ｓiRNA与序列相同但是未经修饰的siRNA比活性相同，但是在细胞培育物中引起的基因缄默现象的时间延长.然而，增多siＲNA中的甲基化核苷,或者在核苷中引入体积较大的烯丙基将导致siＲNＡ活性下降。ﻫRNA干扰在哺乳动物体内的第一个讨论是利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码shRＮA的质粒注入老鼠的尾静脉。在大多数器官中,报道基因（编码于共转染质粒或者转基因小鼠上)的表达可以被有效地抑制。另外,Fａｓ基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了ＲNA干扰实验。注射sｉRNA之后,小鼠肝细胞中的FasmRＮＡ和蛋白水平下降了10天。把Fas基因缄默可以保护小鼠免遭由注射竞争性Ｆas特异抗体引起的爆发性肝炎，８2％用ｓｉRＮA处理的小鼠活过了1０天观察期，而全部的对比小鼠在3天之内死亡。ﻫ上述讨论中采纳的高压导入技术是一种粗暴的方法，不适于治疗用。因此,标准的基因治疗所采纳的方法被用于RＮA干扰。一个反转录病毒载体被用于导入ｓiRＮA，以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因Ｋ－ｒａｓ等位基因。负调控癌细胞中K-ｒａｓ基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成肿瘤的能力。这项讨论还表明ｓｉRＮA的高度特异性，由于只有癌基因K—ras被缄默，而与之只有1个碱基对差异的野生型等位基因并没有被缄默。另外，当在纹状区注射表达sｉRＮＡ的腺病毒之后，转基因小鼠大脑中GFＰ基因的表达可以被抑制.β－葡萄糖醛酸苷酶（ｂ-gｌｕｃorｏｎｉdasｅ）的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制.有趣的是,具有CMV启动子和最小的pｏlyA尾的RＮA聚合酶ＩI表达元件被用于这个实验，为设计组织特异性或者可诱导的ｓｉRNA载体打开了大门.ﻫ总的来说，siRNA的第一个体内实验已经进行,其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展讨论.至今为止的讨论没有观察到任何应用ｓiＲNA引起的毒性作用，但是在治疗人类疾病的临床试验开头之前仍需当心，以排解长期使用RNA干扰引起的严重副作用。由于用ｓｉRNA使基因表达缄默与传统的反义技术相像,讨论者将从十多年来反义技术讨论的教训中获益,比如需要使用合适的对比以证明基因表达的敲除是特异性的,以及对免疫系统可能引起的意外影响进行简略分析。ﻫ经过长期盛衰沉浮,反义技术近年来得到越来越多的注意。对能够提高靶表亲和性和生物稳定性、降低毒性的修饰核苷的讨论取得了重要进展.由于大多数新的DNA类似物不能激活RNasｅH，对反义寡核苷酸的设计需要考虑靶mRNA是否需要保留,例如，是转变剪接方式，还是降解靶mRＮＡ(这种情况下应该使用gapmer技术).可以通过有系统的修饰天然核酶或者通过体外选择技术获得具有高催化活性的稳定核酶.一些反义寡核苷酸和核酶已经进入临床试验讨论,一个反义药物已经在199８年获得批准。一个重要的突破是发现短的双链ＲNA分子可用于哺乳动物细胞中特异性缄默基因表达。这个方法与传统的反义技术比效率明显更高，并且一些体内实验的数据已经发表。因此，反义技术有望广泛应用于对未知功能基因的讨论、药物靶标的确认和治疗。

ＲNAi的发现ＲNA干扰(RNAｉnｔｅｒfeｒence,RＮAｉ)现象是一种进化上保守的抵挡转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物ｍＲNA存在同源互补序列的双链ＲＮＡ（dｏublestrａnｄＲNA,dsRＮA)导入细胞后,能特异性地降解该mＲＮA,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因缄默机制（ｐoｓttranｓcripｔioｎalｇeｎｅｓilｉｅnｃｉng,PＴGS)范畴.ＲＮAｉ广泛存在于生物界，从低等原核生物,到植物，真菌，无脊椎动物,甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象,只是机制也更为简洁.ﻫ早在199０年进行转基因植物有关讨论时偶然发现，将全长或部分基因导入植物细胞后某些内源性基因不能表达,但这些基因的转录并无任何影响，并将这种现象称为基因转录后缄默（poｓttrａnｓｃriptｉｏnaｌgｅｎeｓilｅｎcｉnｇ,PTＧS).１996年在脉孢菌属（Neｕroｓporａ）中发现了相像现象,只不过将这种现象命名为基因表达的阻抑作用（ｑuｅlｌiｎg)．首次发现ｄsRNA能够导致基因缄默的线索来源于线虫Cａenorhaｂdｉtｉseleｇanｓ的讨论。１9９5年康乃尔高校的讨论人员Ｇuｏ和Kemphueｓ尝试用反义RＮＡ去阻断par—1基因的表达以探讨该基因的功能，结果反义RNA的确能够阻断ｐar21基因的表达，但是奇怪的是,注入正义链RNA作为对比，也同样阻断了基因的表达。这个奇怪的现象直到3年后才被解开——华盛顿卡耐基讨论院的ＡｎdｒewFire和马萨诸塞高校癌症中心的ＣｒaｉｇMelｌo首次将双链dsRＮA——正义链和反义链的混合物注入线虫，结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因缄默。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链RNA已经足够完全阻断同源基因的表达.后来的实验表明在线虫中注入双链ＲNＡ不单可以阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其第一代子代的同源基因缄默。他们将这种现象称为ＲＮA干扰。ﻫ过去认为，哺乳动物细胞中不存在RＮＡｉ现象，由于较长的dsRＮA在哺乳动物细胞中能诱导IFN(干扰素)生成,并激活ＳTＡＴ途径参加的PKＲ(dsRＮA依靠性激酶)的转录，同时ｄsRNA本身与PKＲ结合也能令其激活,继而磷酸化翻译起始因子ｅIＦ２a使之失活，导致非特异性的蛋白质合成障碍；另一方面,ｄsRNA又能诱导细胞产生多种抗病毒蛋白的2′，5′腺苷合成酶，生成2′，5′腺苷酸，激活非特异性的RＮA酶L，发生非特异性的RNA降解效应。现在发现,只要ｄsＲNA短于30ｂp，就不会促发干扰素效应,同时又能特异性地降解mRNＡ，引起基因缄默,说明ｄｓRNA在哺乳动物细胞中也能发挥肯定作用,为以后的基因治疗等RNAi应用领域供应了新的讨论方向。ﻫＲＮAi的简略机制和过程还不十分清楚,目前大致分为以下几个阶段进行:①siＲNA的形成阶段:此阶段需要Rde-1,Rdｅ－4和ｄsＲＮＡ特异性的核酸内切酶Dｉcer等共同参加。Ｒdｅ-1，4编码的蛋白识别外源dsRNＡ,引导dsRＮＡ与Dicer结合，然后，Dicｅr将dsＲNＡ解旋,再将其裂解为21—2５nt大小的小干扰RNＡ(smallinｔerｆerｉｎgRNＡ，ｓiRNA）.Dｉｃeｒ定位于胞浆中，但核内ｍRＮＡ剪切修饰后在向核外运输过程中也存在RＮAｉ现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为２1-２５nt大小并在3′端带有2—3个碱基悬端且5′端磷酸化的siRＮA诱导的RNＡi效应最强。Dｉcer家族在进化上格外保守,有5个组成部分:N-端RNA解旋酶结构域、1个PＡZ结构域（Ｐiwi，augonaute，Zwｉllｅ／piｎｅheaｄ，PＡＺ)、２个ＲNａseＩII结构域和C端dsRＮＡ结合基序。Dicer在体内一般是以二聚体的形式发挥作用的,由于不同种族Diceｒ分子大小不一样，所以dsＲNA被切割成的siＲＮＡ大小具有种族差异。②RNA诱导的缄默复合物(ＲNA—ｉnducedsilｉcenciｎｇcoｍｐlｅｘ,RISC）形成阶段:生成的siRＮA和RNAi特异性酶如AGＯ－２、MＵＴ-7、RED－1、PＡZ蛋白和ＤＮA－RNＡ螺旋酶结合形成ＲＩSC,具有序列特异性核酸内切酶、核酸外切酶和解旋酶活性,能特异地降解与siRNA同源的靶ｍＲNA。③效应阶段:siRNA引导ＲＩSC与同源性的mRNA结合，在ＡTＰ及解旋酶(如qde-3,ｍuｔ－6，mｕt-14)的作用下使sｉRNＡ链解离，并使ＲIＳC由25０ｋＤ大小的前体形式变成约10０kD左右活性形式，同时解旋酶催化同源mRNＡ与sｉRＮA的正义链相互交换，核酸酶在mRＮA与反义RNＡ所形成的双链区的5′起始端下游7—１０个核苷酸处切断ｍRNA,起到特异的抑制基因表达的效果。④扩增阶段:该反应以sｉRＮA中的一条链为引物，以靶mＲＮA为摸板，在RNA依靠的ＲNA聚合酶（RNA-ｄepｅndeｎｔRNAｐｏlｙｍerａsｅ，RdRP)作用下，扩增靶mRＮA,产生新的二级sｉＲNA，而这些siRＮA又能连续反作用于靶mRＮA。RdRP不仅能增加sｉRNA的拷贝数，而且能将特别的单链RNA转变dsＲＮＡ。RdRP还是一个重要的“senｓor”，它能识别正常和特别的RNA。转基因RNA和病毒RＮA都是在ＲdRP的识别下启动RＮＡi的反应过程.此外,ＲNAi的扩增效应还可能存在另外两种机制:①Diｃer将长dｓＲNA切成初级siＲNＡ，这一放大水平取决于dsRNA的长度;②siＲNＡ在酶的作用下可以多次应用,产生进一步的放大效应。RNAｉ的作用机制干扰性小RNA(smａllinteｒfeｒingＲNＡ，或sｈorｔintｅrｆeｒiｎgＲＮＡs,ｓiＲNA）是RNA干扰作用（ＲNAｉ）赖以发生的重要中间效应分子.ｓiRＮA是一类长约2１～2５个核苷酸(nt)的特殊双链RＮＡ(dｓRNA)分子，具有特征性结构，即ｓｉＲNA的序列与所作用的靶ｍＲNA序列具有同源性;ｓiRNA两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基.此外，每条单链的3′端均有２～3个突出的非配对的碱基RＮAi的主要过程是，dsRNA被核酸酶切割成2１~2５nt的干扰性小RNＡ（siRNA），由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶ｍRNＡ分子．细胞中ｄｓRNA的形成是RNAｉ的第一步．细胞中dsRＮA可通过多种途径形成，如基因组中ＤＮA反向重复序列的转录产物；同时转录反义和正义ＲNA;病毒RNＡ复制中间体;以及以细胞中单链RＮＡ为模板由细胞或病毒的ＲNA依靠RNA聚合酶（RdＲp)催化合成dsRNＡ等．在线虫（C．elｅgans）可以直接注射dsＲNA或把线虫浸泡在含ｄsRＮA溶液中等方式引入外源ｄsＲNＡ，还可以通过喂养表达正义和反义RＮＡ的细菌获得dsRNＡ。ﻫ现已初步阐明RNAｉ的作用机制。RＮＡi的第一步是，dsRNＡ在内切核酸酶(一种具有RＮaｓeⅢ样活性的核酸酶)作用下加工裂解形成21～２５nｔ的由正义和反义序列组成的干扰性小dｓRNＡ，即siRNＡ。果蝇中ＲNaｓｅIＩI样核酸酶称为Dicer.Dｉcｅｒ含有解旋酶（ｈeｌｉｃａse)活性以及dｓＲNA结合域和PAZ结构域。已发现在Arabiｄopｓｉｓ,C.ｅlｅgans，Schizosａccharｏmycespombe以及哺乳动物中也存在Dｉｃeｒ同类物。RNAi的其次步是,由siＲNA中的反义链指导形成一种核蛋白体，该核蛋白体称为RＮA诱导的缄默复合体（ＲNAindｕcedsilｅｎcｉnｇcｏmｐｌex，RISC），由RIＳＣ介导切割靶mＲNA分子中与ｓｉＲＮA反义链互补的区域,从而达到干扰基因表达作用．RＩSC由多种蛋白成分组成，包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RＮＡ链搜寻活性等。线虫Ｃ．elegaｎs中的MUT7(一种RＮaｓｅＤ样蛋白）可能是一种3′5′外切核酸酶。此外，PＡZPＰiｗｉ蛋白家族成员可能是ＲISC中的构成组分，如Araｂiｄｐｏsiｓ中的ＡGO１;N.Cｒasｓa中的QDE；C。ｅｌeｇaｎs中的ＲDE１等，以上这些蛋白与翻译因子eIF2C同源．ﻫ讨论进一步揭示,ATP在siRＮＡ介导的RNAi中具有重要作用.较长ｄｓRNA向sｉRＮA的转变要有ＡTＰ参加.ｓiＲNＡ与蛋白因子形成一个无活性的约36０kD的蛋白PＲＮA复合体;随之，sｉＲNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白PRＮA复合体（RISＣ)，此步具有ＡTＰ依靠性.ＲISC活性复合体对靶ｍＲNＡ的识别和切割作用,这一步可能不需AＴP参加。ﻫ此外,ATP使siRNA5′端带上磷酸分子,且对siRNA的功能具有重要作用。上述过程中sｉRNA双链结构解旋很可能是一种稳定的结构转变，由于sｉRＮＡ双链体与细胞裂解物、ATP等孵育后再除去AＴP及其它帮助因子,含有ｓiRNA的活性复合体仍能识别和切割靶ｍRNＡ分子ﻫｓiＲＮA可作为一种特殊引物，在RＮA依靠RNA聚合酶(RdRp）作用下以靶mRNＡ为模板合成ｄｓRNＡ，后者可被降解形成新的sｉＲNA；新生成的siRＮＡ又可进入上述循环。这种过程称为随机降解性多聚酶链反应（ｒanｄomdegradaｔｉveＰCＲ）．新生的dsRＮA反复合成和降解，不断产生新的sｉRＮＡ，从而使靶ｍＲNA渐进性削减,呈现基因缄默现象．RdRｐ一般只对所表达的靶mRＮＡ发挥作用,这种在ＲＮAi过程中对靶ｍRNA的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能．每个细胞只需要少量dｓRＮＡ即能完全关闭相应基因表达,可见RNAi过程具有生物催化反应的基本动力学特征．ﻫｍiＲＮA与sｉＲNA的区分：

（1)ｍiRＮA是单链的，而siＲNA则是双链的；ﻫ（２)ｍiRＮA参加正常情况下生长发育基因调控,而ｓｉRＮＡ不参加动物体的正常生长,只有在病毒或其它dｓRNA诱导情况下才产生siRNA，作为mｉRNA的完善和补充；ﻫ（3）mｉＲNＡ在转录后水平调节基因表达，推测在翻译水平也起作用，而ｓｉＲＮA为转录后水平调节基因表达调控;ﻫ（４）Ｄｉcer酶对两类RNＡ的加工过程,miRNA为不对称性，仅来自含茎－环结构RNＡ前体的一侧臂，剩余部分很快降解,而这种不对称性不存在于而siＲNA加工过程中。RＮAｉ的特点①高度特异性:有时siRNA一个碱基转变就会大大降低封闭靶基因的效果.Bｒumｍｅlkamp［4］等利用载体表达的小发夹RNA(smallhａiｒｐｉｎRNA，ｓhRNA）来封闭人MＣF-７细胞的CDH1基因，shＲＮA上仅一对碱基的突变就不能抑制CDH1基因的表达。其中siＲNＡ的中央位置碱基位点和3′末端倒数其次个碱基起了格外重要的作用.ﻫ②高效率：在细胞内ＲNAi途径一旦被启动，反应信号就被放大。在低等动物中靶基因表达抑制效率大于９0％，甚至有人认为每个细胞一份拷贝的dｓRＮA就可以封闭基因的效果。ﻫ③高成功率：RNAi已被用于线虫全基因组的功能分析,其中有50％—80％序列选择有效，12.9%—２7％的基因封闭产生了明显的特别表型。ﻫ④种属时—效性：Ｉｒｉｅ等人发现，在低等生物中RNAi可持续存在,但RＮＡi在哺乳动物细胞中只能维持一段时间,一般注入dｓＲＮA后的2-3天，ＲNAi的作用最明显，尔后1-2天内，靶mRNＡ的丰度就能恢复到注射ＲＮAi之前的水平。这可能是由于RNA依靠的核苷脱氨酶脱氨基活性的逐步增高导致ｓｉＲＮA的生成削减而受到抑制。

⑤dsRNA的长度限制性:引发有效RNAｉ的dsRNＡ最短不得短于2１nt，Dicｅr能与20０-5０0ｎｔ范围内的dｓRNA结合，底物片段越短,Ｄｉcｅr酶的活性也就越弱,提示RNＡｉ具有ｄsRNA片段长度限制性。⑥ＲNAｉ的遗传性:1998年Fｉre等就发现在线虫中RNAi可以传代,以后Worbｙ等人在果蝇的培育细胞中也发现了类似的现象。线虫中的ＲNＡｉ遗传性需要Rｄe-１和Ｒｄｅ－２来启动.ﻫ⑦传播性：RNＡｉ效应可以在细胞间集中，ｄｓRNA可在果蝇细胞群落之间传播,在线虫局部注射dsＲNA也可传播到整个机体。Van等讨论发现sｉｄ－1基因编码一种具有十一次跨膜蛋白可能与此现象有关。

⑧ＡＴP依靠性:在去除ＡＴＰ的样品中ＲNAi现象降低或消灭，显示RNAｉ是一个ＡTP依靠的过程,可能与Dicer和RISC的酶切反应必须由ＡTP供应能量有关.⑨模板选择性：RＮAｉ只有效作用于外显子,而对内含子无影响.ｄsＲNA序列是某个基因的启动子序列时也没有明显的效应。另外,RNAi对稳定并丰富表达的靶基因抑制效率也不高。RＮＡｉ的生物学意义及其应用ＲNＡｉ的生物学意义主要是维持基因组稳定、抑制转基因表达和保护基因组免受外源核酸侵入。讨论证实RNＡｉ缺陷可引起内源性转座子的移动。转座子缄默与DNA甲基化、H3mK9(hiｓｔｏnｅH3lｙｓｉne－9meｔｈｙｌation）和ＲＮAi有关，大多数转座子缄默与ｍet1（ＤNAmetｈyltｒansfeｒａｓｅ)、ddm1(dｅcreaｓｅinＤＮAｍethｙlaｔion1）和ｓil１(Streptｏmyｃesｓｕbtｉliｓiniｎｈibitor—like１）有关，而很少的转座子缄默需要KRYＰTOＮINＥ（H3Ｋ9mｅthyｌｔransｆerasｅ)、ＡＲＧOＮＡＵTＥ１(ＲNAｉｇenｅ)和CHROMOMEＴＨYＬASE３(ＣXGmｅtｈｙltrasfｅｒase）。Ｈaｌｌ等讨论表明，着丝粒同源重复序列和RNAi组分一起正负调节着异染色质的形成并且共同促使异染色质组装成核。最近讨论发现，ＲNＡｉ需要的一种AＧＯ蛋白TｂAGO２与细胞有丝分裂和染色体分离有关。dｓＲNA还消灭在很多病毒(包括单链RNA病毒）感染的细胞内,诱发ＲNAi而封闭病毒生存和繁殖所必需的基因或激发干扰素诱导的抗病毒效应.RNAi还可能在胚胎发育过程中具有重要功能,也可能参加了生物体正常的基因表达调控，同时与基因印迹也有关。ﻫRNＡi是一种高效的特异性强的基因阻断技术，近年来进展飞快，很快就成为功能基因组讨论的有力工具。通过实验手段将dｓRNＡ分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其序列同源的mRＮA,封闭内源性基因表达,从反向遗传的角度讨论人类或其他生物基因组中未知基因的功能。早期就有人应用此项技术分离了果蝇胰岛素信号转导途径通路中的各种成分。近来也有实验报道通过ＲNAi讨论细胞内脂质平衡过程中涉及的各条途径。在这之前，曾利用反义RNA与靶mＲＮA序列互补的特性来抑制其表型的发生，但由于反义RNA对内源性表达的基因抑制作用较弱，往往会产生一些过渡表型,易造成对基因功能推断错误,目前已通过审批认为临床上具有治疗作用的仅有一种药物———Ｖitraｖenｅ.ＲNAｉ技术与之相比，特异性更高，作用更飞快,副反应小,在有效地缄默靶基因的同时,对细胞本身的调控系统也没有影响。最近在人类体细胞里已经成功地对近20种基因功能进行了“敲除”，尤其是因此而了解了人类空泡蛋白Ｔsg1０1对HIV在人体内增殖的作用，进一步深化了对HＩV的讨论。Leonｉd等以脊髓灰质炎病毒为模型，利用RNAｉ来诱导细胞的胞内免疫,产生抗病毒效应，尤其是针对ＲNA病毒。对于易突变的病毒,可设计多种靶向病毒基因保守序列的dsＲＮA，削减它对dsＲＮA的抵抗。Mａｅn等也应用RＮＡi技术成功地阻断了MCＦ-7乳腺癌细胞中一种特别表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Ｓp21的功能.RＮAi技术的应用，不仅能大大推动人类后基因组计划（蛋白组学)的进展,还有可能设计出RNAｉ芯片，高通量地筛选药物靶基因,逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能,并且它还将应用于基因治疗、新药开发、生物医学讨论等领域,用ＲNＡi技术来抑制基因的特别表达，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。ﻫ简略可用于以下几个方面：ﻫ１基因功能分析ﻫ基因敲除技术需要较长时间去永久性的关闭某个基因的表达，而RＮAi技术则可在一周内、甚至2天内可控性的关闭10个基因.RNAi技术还具有一个优势,能同时封闭多个基因或基因家族，用于讨论ｍＲＮＡ差别剪接形成的异构体,甚至在基因组水平上构建针对基因组的RＮAi表达载体,用于讨论基因之间的相互作用和进行基因功能的高通量筛查.使用RNＡi技术在那些低等生物中基因组功能测定都已基本结束.在哺乳动物和人类基因的功能讨论中,Ｈaｒbｏrｔh等利用脂质体及质粒分别将编码核纤层蛋白β1或β2、NＵP1５3、GAＳ41、ＡRC2１、胞质动力蛋白、蛋白激酶cdk１、β或γ肌动蛋白以及非必须结构基因ｅmerin和zｙｘin的siRNＡ转染到Helａ、ＳＳ6细胞和大鼠F５、FR成纤维细胞内，结果发现上述基因的功能表现与以往使用基因剔除法获得的信息全都。Sｕi等应用DNＡ载体体外构建目的基因的siRNA，包括外源绿色荧光蛋白、内源Lamｉｎ－A、Lamin-Ｃ、cdｋ—2和dnｍt-１基因，转染Hｅla、Ｈ１229、C－33Ａ、U-２OＳ细胞,结果显示siRNA对目的基因的抑制作用均在86％以上。ﻫ2讨论信号传导通路的新途径ﻫ联合利用传统的缺失突变技术，ＲNＡi技术可以很容易地确定简洁的信号传导途径中不同基因的上下游关系,Cleｍeｎs等应用ＲNAi讨论了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径，取得了与已知胰岛素信息传导通路完全全都的结果,在此基础上分析了DSH３ＰＸ１(Docksrｃｈｏmolｏgy3phox１）与DAＣK（DrｏｓopｈilａactivａtedCdｃ42tｙrｏｓinｅkinasｅ)之间的关系，证实了DＡCK是位于DSH３PＸ1磷酸化的上游激酶。ﻫ3新药物的讨论和开发ﻫRＮAi还可以作为寻找新的药物靶标的工具，可以高通量地发现药物靶基因，帮助新药物的讨论和开发，了解药物作用的生化模式等。Makiｍura等利用ＲＮＡi技术削减了丘脑下部ＡGRＰ（agｏuｔi—ｒeｌeｔedpeptiｄｅ）５0%的表达量，AGＲP使代谢率提高而不削减摄食量,从而减轻肥胖,为肥胖的治疗供应了一个靶点。美国Gｅｎeｔica公司已将ＲNAi技术作为高通量药物靶标识别和确认的工具.ﻫ4基因治疗ﻫＲNAｉ只抑制致病基因,而不影响正常等位基因的功能，具有较高的选择性和特异性，能削减非特异作用引起的副作用。ﻫ4。１治疗病毒感染

可将ＲNAｉ视为一种与免疫系统类似的防御机制,利用ＲＮAi技术进行病毒感染的干扰实验已在植物及低等生物中取得满意的结果,但在人体细胞内的实验才刚刚起步.已有讨论表明,用siRNA抑制HIＶ的某些基因,如p24、ｖｉf、nef、tat或ｒev可阻碍ＨIV在细胞内复制;抑制ＨIV的受体CＤ４和ＣD8a或帮助受体CXＣＲ４或CCR5或病毒结构Gag蛋白表达可阻碍HIＶ感染细胞.所以应用sｉRNA可能成为防止HＩV—1感染的一种有效手段.Hamａsaki等构建的siＲNA特异性表达载体与HBV病毒DNA共转染人肝癌细胞ＨuＨ7和HeｐＧ２,降低了RNA及其复制中间体的水平,并引起HBeＡｇ分泌的下降。最近,Soｎｇ等通过RＮAｉ技术使Faｓ基因缄默,成功地在自身免疫性肝炎小鼠模型中预防了肝衰竭和肝纤维化。ﻫ4．2治疗肿瘤ﻫ肿瘤发生是多基因相互作用的基因网络调控的结果,传统技术诱发的单一癌基因的阻断不行能完全抑制或逆转肿瘤的生长,而RＮＡi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性,设计针对这一区段序列的dｓRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时缄默的效应，也可以同时注射多种dｓRNA而将多个序列不相关的基因同时缄默。Ｃiｏca等利用粒细胞白血病细胞系讨论了Ｒａf-1和ｂｃｌ-2基因在白血病中的作用，表明ＲＮAi能诱导细胞凋亡并能提高肿瘤细胞对化学治疗的敏感性。Zhａｎg等将针对鼠源VＥＧF（VａscｕlarＥndotｈｅｌiaｌGroｗthＦactor）各亚型基因的siRNA构建成的ＲＮAi表达载体,均特异性抑制了各亚型ＶＥＧF的表达,有效的抑制了肿瘤细胞的生长。β—连环蛋白和APC基因是Wｎt信号通路中的重要组分,突变后引起细胞特别增殖，在肿瘤的发生中起重要作用。Verma等利用RNAi技术使这两个基因表达降低,在细胞和裸鼠中都能抑制肿瘤细胞的增殖。以ｅrbB1、端粒酶为靶点，利用RＮAｉ技术抑制肿瘤的讨论也取得了满意结果.ﻫ5其它应用ﻫＲＮAi还可用于细胞周期调控、代谢、膜转运以及DＮA损伤反应、转录或甲基化等多种方面的基因功能讨论.最新讨论发现,用ＲNAｉ技术阻断Nrｄｐ１（为ErbB3成员）、BRUCＥ（为一个5３0ｋDa的膜相关凋亡蛋白抑制因子）、Cｈｋ1、Ｗee1和Mｙｔ１等进一步解释了细胞凋亡的机制，其中BＲUＣE通常可抑制凋亡,而Nｒｄｐ1在凋亡初始阶段起到格外重要的作用。RNAｉ相关术语１．ＲNAi：(RNＡiｎterfｅrencｅ）RNＡ干扰一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达,促使ｍRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为ＲＮA干扰(RNAｉntｅrｆeｒｅｎce，RNAｉ,也译作RNA干预或者干涉)。它也是体内抵挡外在感染的一种重要保护机制。２．sｉRNA：(smallｉnterｆeringRNＡs)小干扰ＲＮＡ一种短片断双链RNA分子,能够以同源互补序列的mＲNＡ为靶目标降解特定的mRNＡ,这个过程就是RNA干扰途径（RＮＡinｔerｆeｒenceｐａthwaｙ).3.ｓｈRＮＡｓRNA—SｈｏrthａirpinRNＡｓ）短发夹RNA是设计为能够形成发夹结构的非编码小ＲNA分子,短发夹RNＡ能够通过RＮA干扰来抑制基因的表达。ThomaｓRoｓｅｎｑｕisｔ'sｇｒouｐ和ＧregＨannｏn'sｇrｏup联合讨论了在哺乳动物种系细胞中shＲNAs的转移导致基因长时间稳定缄默的机制。４。bpＢａsｅＰaｉr）碱基对两个碱基（A和T，或者C和G)之间靠氢键结合在一起,形成一个碱基对。ＤNA的两条链就是靠碱基对之间的氢键连接在一起，形成双螺旋结构。５。Basｅｓｅquence:碱基序列ＤNA分子中碱基的排列挨次。6.BasｅＳｅｑｕenceAnalysis:碱基序列分析分析出ＤＮA分子中碱基序列的方法(这种方法有时能够全自动化)ﻫｃＤNA：参见互补DNA。7.cＤNA:互补ＤNＡ以信使RNA为模板合成的DNＡ，常常采纳互补ＤNA的一条链作为绘制物理图谱时的探针.８。Compｌｅｍentaｒyｓeqｕence：互补序列以一条核苷酸链为模板，依据碱基互补规章形成的互补链，称为该模板的互补序列。９.GeｎomｉcLiｂrarｙ:基因组文库对某个染色体，制备随机产生的、相互之间有重叠部分的片段的克隆。10．RIＳC：（RNA—inｄｕｃedｓｉｌenｃiｎｇcomplｅx)RＮA诱导缄默复合物在RNAi效应阶段,siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导缄默复合物。激活ＲＩSＣ需要一个ＡTP依靠的将siRNＡ解双链的过程.激活的RISＣ通过碱基配对定位到同源mＲＮＡ转录本上,并在距离siＲＮＡ3'端1２个碱基的位置切割ｍRNA(3,1８,2７,２9）。尽管切割的精确机制现在还是未知，讨论表明每个RIＳC都包含一个sｉRＮA和一个不同于Diｃｅr的RNA酶。１1．Diｃeｒ：Dicer酶ＲNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员,能以一种AＴP依靠的方式逐步(pｒｏｃessiｖe）切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为１9—21ｂｐ的双链ＲNＡs（sｉRNAs）,每个片断的3’端都有２个碱基突出（27，28）。1２。PTＧS：(Post－transcriｐtｉonａｌGｅnｅＳiｌenｃｉng,PTGＳ）转录后基因缄默部分的植物中的基因缄默是在转录后发生的。它是相对于部分植物中发生的转录阶段的基因缄默(TＧS)而言的。１3.TＧS:（ｔｒａnsｃｒｉptionａlｇeneｓiｌencing）转录阶段基因缄默14.ｇｅnesｉlence：基因缄默讨论结果发现有大量的转基因植株不能正常表达，通常这并不是由于转基因的缺失或突变引起的，而是基因失活的结果.这种失活的现象称为基因缄默。1５.ＲNAtrａnsfectiｏn:RNＡ转染。16。SenｓｅＲNＡ:正义链RＮA17．AntｉsenseＲNA:反义链RNA。１8.1922ntsiRNA:在细胞中双链RNA一般都被切割成２1－23小片段，这样的ＲＮA片段能达到更好的RNAi作用.人工合成的siRNA也是依据这个原理,所合成的ＲNA就是19nt的碱基序列再加上两端的识别序列如－GＧ,-ＴT等.1９.SＥCｓｓｉRNAexｐrｅｓｓiｏncａsseｔｔeｓ）sｉRNA表达框架一种由PＣR得到的siＲNＡ表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。20.Homｏloｇiｅｓ：同源性指同种类不同个体或者不同种类个体之间的，染色体或者蛋白质序列的相像性21。HｏmｏloｇoｕｓCｈromｏsomｅ:同源染色体一对染色体，分别来自父本和母本，染色体上有着相同的线性基因序列。22。ＲecombｉnａｎｔCloｎｅ:重组克隆ﻫ将不同来源的DNＡ片段合成在一个ＤNＡ分子中，这种技术称为重组,得到的分子为重组克隆。２3.Riｂonucleｉcａｃiｄ：核糖核酸RNA从细胞的细胞核和细胞质部分分离出来的化学物质。在蛋白质合成和其他生化反应中起着重要作用，RNA的结构和DNA的结构类似，都是有核苷酸依据肯定挨次排列成的长链。RＮＡ可以分为信使ＲＮA、转运RNA、核糖体RＮA以及其他类型的ＲＮＡ。2４.ｒＲNA：（RNARiｂonsｏｍalRＮA，核糖体)存在于核糖体中的RNＡ。25。Ｒibｏｎsoｍｅ:核糖体细胞质中含有ｒRNＡ和相关蛋白质的细胞器,是蛋白质的合成场所.2６.Transfoｒｍation：转化将外源DNＡ整合到某一细胞基因组中的过程。2７．Ｅｎｔreｚ：美国国家生物技术信息中心所供应的在线资源检索器。该资源将ＧenBaｎｋ序列与其原始文献出处链接在一起。28。ＮCBI：(ＮatiｏnａlＣｅｎtｅrｆoｒBioｔechnolｏgyＩnｆormatioｎ）美国国立生物技术信息中心为美国国家医学图书馆(ＮLＭ）和国家健康协会(NIH）下属部门之一,１98８年设立.主要供应生物医学领域的信息学服务，如世界三大核酸数据库之一的GｅnBank数据库，PｕbMed医学文献检索数据库等。29。GｅｎBaｎk：NＩH的基因序列数据库是全部公开的DNA序列的集合(NucleｉcAcidsResｅarch１9９８Jan1；26（１）：１—７）。截至1９98年1２月,GeｎＢanｋ大约收集了2,１６２，０００，00０个碱基、3，044,００0个序列。３0.ＲibｏｓoｍａｌＲNＡ：(核糖体ＲＮA,简写为rＲNA）是一组存在于核糖体中的RNA分子。３１.UｎｉGene：美国国家生物技术信息中心供应的公用数据库,该数据库将ＧeｎＢaｎk中属于同一条基因的全部片断拼接成完整的基因进行收录.３2．BLAST:（BａｓicLoｃalAliｇnmｅｎtSｅaｒchＴool）基本的基于局部对准的搜寻工具一种快速查找与给定序列具有连续相同片断的序列的技术。是一个序列比对Ａｌignｍｅnt应用程序。它可以在线选择服务器上的数据库进行序列比较包括DNA／DＮＡRNA/DＮA蛋白/蛋白序列比对序列比对的作用很多如同源核酸或蛋白序列的查找引物或探针特异性分析物种进化树的构建等等目前多数网站和软件均供应免费的BＬAST的本地或在线检索比较闻名的供应序列比对服务有NCBI的BLAＳT检索如果需要简略了解这个程序可到ＨYPEＲLＩNK”ｈtｔｐ：//wwｗ。nｃbi.nlm．ｎｉh.ｇｏv/ＢLＡＳT／＂http：/／wｗw.ncｂｉ。ｎlｍ.nih。ｇov／BLＡＳT／去简略看一看帮助文件但是上NＣBＩ需要国际代理国内的伴侣可通过上海生科院的生物信息中心进行BLAＳT网址ＨＹPＥＲLINK"ｈｔtp://ｂioinｆo。biosｉｎｏ．orｇ：88８8/ｂlａst/”hｔtp：/／bioｉｎｆo。ｂｉｏsｉｎｏ．org：8８８8/blast／速度不错3３．RＴ-ＰＣＲ：逆转录PCＲRT—PCR是以RNA为起始材料经逆转录反应产生cＤNA,再以cＤNA为模板进行PCR扩增，而猎取目的基因或检测基因表达。３4．DNＡ印迹杂交：（DNＡｂlｏｔhyｂｒｉｄizatｉon）有两种核酸印迹法:•将DNA或ＲＮA溶液直接点样于硝酸纤维素膜或尼农膜上（斑点或狭线印迹)

•经琼脂糖凝胶电泳将片段的ＤＮA或RNA转移到膜上(Sｏｕtｈern和Noｒtherｎ印迹法).DＮＡ在电泳前先用限制性内切酶消化。35．RNA印迹杂交：（ＲNＡblotｈyｂriｄizａtｉｏn)RＮA印迹杂交是一种检测已固定在滤膜上的总RＮＡ或mRＮA特定靶序列的技术.36.RNA酶掌握：在实验中前期的质粒的构建和提取是要用到RNAseA这种酶的存在会降解后期要转录生产的ＲNA如果前期消灭了这个酶的污染就会导致后期实验的失败,而后期转录是又要用到其他的RNA酶，如ＲNA聚合酶3等,因此在实验中严格掌握好ＲNA酶是RNA实验的关键,简略的做法是做到DＮＡ，RNＡ移液器的专用，DNA实验室和ＲNA实验室的物品和器械分开使用，将实验室中的任务污染源削减至最低.

RＮAi技术关键问题低等生物对ｄｓＲNA或siRＮＡ导入的条件要求较低,成功率较高，但对较高级的哺乳动物和人类细胞株的转染成功率却不抱负.哺乳动物的细胞对ｄｓRNA的导入具有抗拒性,并且值得注意的是大于30ｂｐ的dｓRNA导入哺乳动物细胞可诱导干扰素的合成结果是非特异性的和全面的抑制基因表达，最终导致细胞凋亡；同时ｄsRNA具有浓度依靠性，ｄsＲNA诱发的RNAｉ效应的强度随着其浓度的增高而增强，但是浓度过高RNAi效应也会降低等。RNAi在哺乳动物中的实验遇到的另一问题是RNAi衰减现象，siRＮA被导入细胞后RNAｉ效应仅持续数天便逐渐消灭。此外RＮＡi技术和反义RNA技术一样,有一些如寡聚核酸合成困难、易被降解、导入困难等相像的缺点.ﻫ（1）ｄｓRＮA序列的选择dsRNＡ主要选自已知的cＤNA的开放阅读框架(ORF)中的基因区域。为防止mRＮＡ调控蛋白对RＩSＣ与靶RNA结合的干扰,应避开选择包括:1）起始密码子下游或终止密码的50~100核苷酸位置以内的区域；2)5′或3′端的非翻译区域；３）内含子区域。此外,序列选择时也应避开多聚鸟苷酸序列区（≥３个），由于这样容易形成四聚体结构，抑制ＲNAi作用.选择与靶mRNＡ上序列互补的21~２3个核苷酸长度的片段,以AA开头为佳,由于此法能简化dsＲＮA合成过程，降低成本，而且合成的dsRNA能更好地抵抗RNA酶的降解。另外，尽量使ｄsRNＡ序列中的GC含量接近5０％(４5%～55％最佳），高GC含量能明显降低基因缄默的效应.选择前可以搜寻BLＡSＴ数据库，保证无其他与靶基因同源的基因存在，避开引起对其他相像基因的缄默作用。并不是全部的mRNA均对RＮＡi敏感。为确保靶基因表达的有效抑制,最好同时合成两个或以上的针对同一基因的不同靶区域的dsRＮＡ;而且,标记dsRNA正义链的3′端对RNＡi现象并没有影响,现有的实验尚未发现mRＮＡ的二级结构对RNAi有任何显著的影响。目前,RNAi技术主要以哺乳动物细胞为对象讨论其基因的功能。但>３0bｐ的dsＲＮA在哺乳动物细胞中会引起干扰素样效应，导致非特异性反应。因而直接选用其下游的产物分子ｓiRNA来代替，达到基因讨论的目的.ﻫ(2）dsRNA的导入方法不同的生物体可以选择不同的方法。简洁生物,如单细胞生物等，可选用电穿孔的方法;较简洁生物可选用dsRNＡ微注射入生殖细胞或早期胚胎，线虫也能采纳肠道或假体腔注射的方法，与微注射相比,RNＡi效率上并无显著差别。还有浸泡法、工程菌喂养法、磷酸钙共沉淀法等.若使用的是化学法人工合成的siRNA（正义链和反义链),还要经过退火过程，以双链的形式导入靶细胞。有人提出了以质粒或病毒为载体,通过转导或转染途径,在细胞内以DNA为模板,利用RＮＡ聚合酶Ⅲ，转录为sｉRNA（直接形成双链或通过回文序列折叠后形成发夹结构）,也能产生较明显的ＲNＡi效应.最近,又有一种新的导入方法，就是借助高压水枪的外力将构建的质粒直接自小鼠的尾静脉注入体内,观察RNAi在活体生物模型而不是培育细胞上的基因缄默效应,但观察到的sｉRNA的半衰期较短，而且由于使用了高压的外力，过程较简洁，限制了其在人类疾病治疗方面的应用。而Ｐａchｕk等则提出了肌注的方法，将针对IL—12的siRNＡ的质粒表达载体导入小鼠体内，得到的ＲNAｉ效应更持久。ﻫ（3）发夹样结构的ｓiRＮA实验证明,发夹样siRNA能延长在细胞内的作用时间.此类结构可由具有回文序列的核苷酸链形成.但通常回文结构不易获得,也可用头碰头的对称序列来代替.转录发夹样ｓiRＮA的模板必须与载体转录启动子紧密相连,而且尽可能有最短的多聚腺苷酸尾巴，这样才能诱导高效的RNＡi效应。Paｄdisoｎ等提出类似的结构也可应用于长片段dsRNA（5０0bｐ左右),而不会引起ＲＮA非特异性的降解.这为检测哺乳动物细胞中经过长期发育后的基因功能供应了新的途径.RNAｉ抑制病毒讨论技术路线ＲＮAi最主要的作用是一小段（大约2１—2３ｂｐ）的双链RNＡ分子（doubｌe-stｒａinｄｅｄRＮA,dsRＮＡ）它介导细胞内序列特异性基因表达阻断或封闭，也就是转录后基因缄默（posｔ-ｔranscｒiｐtｉoｎaｌgeｎesilｅnｃinｇ，PＴＧS）,从而起到掌握细胞的各种高级生命活动。ﻫ１．RＮAｉ的作用水平ﻫRNAｉ是在多重水平上发挥作用的。最先在华丽新小杆线虫中发现，dｓＲＮＡ所诱导的基因缄默在转录后水平，由于dsＲＮA导致了相应ＲNA(mRNA)的降解,而基因启动子和内含子序列作为基因缄默触发物则无效.后来在植物中也发现,ＲNAi引起的基因缄默也是在转录后水平.

除此转录后水平降解ｍRNA的机制外,RNAi还通过其他机制来影响基因表达。在植物中,ｄsRNA导致基因组中与缄默触发物同源序列的甲基化;如果与缄默触发物与启动子序列相同,则引起转录水平的基因缄默.而另外的讨论还发现,在华丽新小杆线虫中，ＲＮAｉ装置中,内源性编码的诱导剂，是在蛋白质合成水平发挥作用的。ﻫ2．RNＡi的作用的基本过程

第一步：起始步

缄默触发物被裂解，产生小干扰性ＲNA(smallｉnterfｅringRNＡs，siＲNAs）。讨论表明，果蝇胚胎提取物就有将长链dｓRNA底物裂解为长度在约22bp小片段的活性。这些siRNＡs是双链的，有磷酸化的5ˊ端。这一过程,可能与RnaseⅢ家族的功能有关.该家族中有一类已被命名为Diｃeｒ酶，含2个催化结构域、1个螺旋酶结构域和1个PAZ基序.遗传学讨论表明,Dｉｃer酶结构在多种生物体之间比较保守.

其次步：效应步

siＲＮAs与多种亚单位形成复合物-ＲNＡ诱导的缄默复合物（ＲISC),然后以RIＳC的方式降解单链的靶ｍRNＡ。在RISC中，这种大小约22bｐ的ｓｉＲNＡs所起的作用，是以碱基配对的原则,识别与dsＲNＡ相同序列的靶mRNA，引导复合物中的RＮA降解酶RＮａse，确保对特定的序列的靶ｍＲNＡ进行降解。ﻫ第三步：缄默效应的放大和集中

在华丽新小杆线虫中，RNAi能够集中到整个虫体，即使只有少量的触发物dｓRNＡ；在植物中也发现了相像的情况，缄默效应集中到整株植物，并可转移到嫁接的幼芽。讨论发现，西红柿中ＲNA指导的RＮA聚合酶（RdＲＰ)与RNAi的集中有关;而华丽新小杆线虫和植物中ｄsＲＮA诱导的基因缄默所需要参加的蛋白质，在序列上与西红柿的这种RdRP很相像；在其他生物体中，起RdRP作用的分别可能是:拟南芥属-ＳＤE１／SGＳ2,脉孢菌属—QDE-１,胚系华丽新小杆线虫—ＥＧＯ－1，华丽新小杆线虫成虫—RRＦ—１/RDＥ-9；而病毒诱导的基因缄默（VＩＧＳ)，则是螺旋酶。有学者认为,缄默效应的放大和集中,是RdRP激发了另外的dsＲＮＡ合成。RNＡi技术及其实验操作－RNAi技术关键问题

哺乳动物细胞的RNAi技术策略ﻫ一、靶ｓiRNＡ序列选择靶siRNＡＡ序列选择是ＲＮAi实验成败的关键.哺乳动物细胞ＲNAｉ实验中,使用最广泛且最有效的是2１bpsｉRＮＡ。sｉRNA由正义链和反义链组成，两条链3’端均有２个碱基突出,一般为ＵU或ｄTｄＴ，其中正义链的前１9nt与靶基因序列相同.1。siRNA设计的原则ﻫSiRNＡ双链设计时，一般在靶ｍRＮA起始密码下游10０—200ｂｐ至翻译终止密码上游d0—1０0bp的范围内搜寻AＡ序列，并记录每个AA3’端相邻1９个核苷酸作为候选si．RNA靶位点。其中AＡ（N1９）TＴ是最抱负的序列，若靶mＲＮA中无此序列,亦可选用NＡ(N21）或ＮAＲ（N１7）ＹＮN（R表示嘌呤,Ｙ表示嘧啶)，但在合成时，sｉＲNＡ的正义链３’端需用dＴ-ｄT代替。TuscRｌ等建议设计的siRＮA不要针对mRＮＡ的５’和3'端非编码区，由于这些区域有丰富的调控蛋白结合位点,而UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP（ｓiRNＡproteｉｎcoｍplex，核酸内切酶复合物）结合mRNA，从而影响ｓiRNA干扰的效果。最后还应将候选siＲNA序列在GenＢaｎk进行BＬＡST检索，与非同源基因具有３个或３个以上碱基相异的序列方可选用。2。高效ｓiRNA的序列结构特征ﻫ除了靶序列位点的选择，sｉIRＮA序列本身结构特征亦会影响到RNAi效率。ＲNAi实质上可视为一个RNA与蛋白质互作过程,包括siRＮA与ＲＩＳC结合、RIＳC的激活以及ＲＩSC与靶mRNA的结合和切割,这种互作效应的存在,往往造成siRＮA链的选择具有偏爱性。Ｒｅｙnolds等通过对２个基因的18０条siRNA序列分析,归纳出以下8个与ﻫｓiＲNA高效性相关的特征：Ｇ/C含量低（3０％—５2%），正义链３’端具较低稳定性（有利于sｉRNA与RISC的结合和解链),无反向重复序列(有利于减小siRＮＡ的有效作用浓度，提高siＲNA干扰效率)，正义链碱基的偏爱性Ａ１9(正义链中第19位碱基为A，如下表示类同）；A3；Ｕ1０；无G／C（正义链中第19位碱基不为G或C)；无G13。依此规章,Reyｎolｄｓ等设计的3０条sｉRNA中有29条是有效的.Kuｍikｏ等亦认为siRＮA反义链5'端为A/Ｕ(即有义链Ｕ／A)１９和最后7个碱基中有5个A／Ｕ，会有助于ＲNAｉ的高效发挥，且正义链Ｇ/Ｃ１和序列中无连续9nt以上的ＧＣ重复片段与基因缄默效率呈显著相关.有趣的是，该实验还表明这些规章同样适用于DＮA介导的RNAi（DＮA—baｓedRNＡｉ.）实验。此外,Ａmarｚｇuｉouｉ等发现正义链５’与3'端的前3个碱基中A/U含量不对称(3'端含量应高一些)和A６对siRＮＡ的活性亦影响很大.依据上述结果,可以初步绘制出一个高效ｓiＲNA序列结构的精细与简略示意图。现已知道sｉRＮA的反义链决定着靶位点识别，那么在不影响siＲNＡ作用功效的前提下,是否可以对其正义链碱基作适当更改或修饰呢？Ａmarｚgｕｉｏui等讨论siRNA不同部位对碱基突变和化学修饰的耐受性，认为siRNＡ的５’端相对于３’端具有对突变的较高耐受性.有学者认为正义链3'突出端的任何碱基修饰对siＲNＡ作用效果均无明显影响.还有学者认为与反义链互补的正义链３’端发生1—４个碱基的错配反而有助于增强ＲNAI的活性.二、sｉＲＮＡ制备方法目前为止较为常用的5种制备ｓｉRNAs的方法包括化学合成ﻫ体外转录ﻫ长片断ｄｓRNAs经ＲNａseIIＩ类降解（e.g.Dicer，E。colｉ,RNａsｅＩIＩ）

sｉRNＡ表达载体或者病毒载体在细胞中表达sｉRNAsﻫPCR制备的sｉRNＡ表达框在细胞中表达三、sｉＲNA的转染将sｉRNＡ、sｉRNＡ表达载体或SECs导入哺乳动物细胞中是诱导RＮAI发生的关键.有很多转染试剂可供选用，最常用的是脂质体转染试剂.某些情况下电穿孔法亦可用，但易导致较高的细胞毒性反应。对于同一细胞系，使用不同的转染试剂或方法，其效率往往会有所不同；而对于不同的细胞系,使用同一种转染试剂或方法,效果亦会不同.因此在实验过程中,有必要尝试多种试剂或方法来确定最优条件。转染效率可通过测定细胞的密度,转染的时间和sｉRＮA与转染试剂的比例来评价.四、实验对比设置实验对比是衡量RＮＡi．实验数据可信度的一个重要因素.设立阳性对比目的是通过检测不同浓度的sｉRNA转染效率及其最终干扰效果，来确定合适的转染条件和最低有效的SIRＮA浓度。有实验表明RＩＳC复合物具有饱和性,且过多ｓiＲNA会导致细胞毒性和死亡。对于大多数细胞，持家基因（如GAPDＨ，c-cｍyc，β—ａｃｉoｎ等)是较好的阳性对比，针对这些基因的高效ＳIRNA序列已有报道。阴性对比是用来检测RＮAｉ的特异性。通常作为阴性对比的ｓｉRＮＡ与选中的siRＮＡ序列有相同碱基组成,但与靶mRＮA无明显同源性。阴性对比的siRNＡ序列设计有2种方法,一是将特异性ｓｉRNA的序列打乱，即“零乱"ｓiRＮA（ｓcramｂledｓiRNA),再对其进行BLＡST比对，防止与目的靶细胞中的其他基因有同源性；另一种是在特异性ｓiRNＡ中引入几个错配碱基.若引入的是一个碱基错配，应需考虑它与突变mRNA(即SＮP位点)结合能力，最好在设计siRNA时就避开SNP区。五、RＮＡｉ效果检测ＲＮAi效果可从mＲNA和蛋白质两个水平来进行量化.在ｍRＮＡ水平上，ＮoｒtheｒnBlｏt和实时定量PCR是两种常用方法。值得注意的是在进行实时定量PCR时,cＤNA合成要用oｌｉｇo（dT），而不是随机引物，且预扩增片段最好位于靶ｍRNA序列中siRNA位点的上游。蛋白质水平可以通过WeｓｔｅrnBlｏｔ、荧光免疫检验法、流式细胞分析术和表型分析来检测。RＮAｉ一般在转染后24小时内发生，其引发基因缄默的程度和持续时间依靠于靶蛋白质的降解率（ｔuｒnｏｖｅrrateｏfｔheｐrotein)、ｓiＲNA在细胞内的寿命以及其逐渐被稀释的程度.ＲNAi实验方法(一）siRNA的设计ﻫ1。在设计ＲＮＡi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选:ﻫHYPＥＲLＩＮK"hｔtp：／/www．geｎｅsil．com/ｂuｓinｅss/pｒｏdｕｃtｓ/oｒdｅr2。htｍ”htｔp：//ｗwｗ。geｎesil．ｃom/business/prｏｄucts／ordeｒ2。ｈｔmﻫHＹPERLINK"ｈttp：／/wwｗ.ａmbｉoｎ.ｃoｍ/tｅchlib／mｉsｃ/ｓｉRＮA_findｅr。hｔmｌ＂ｈtｔp://ｗwｗ.ａｍbion．cｏｍ/ｔechlib/miｓｃ/ｓiRNＡ_ｆiｎdeｒ。ｈtｍlﻫHＹPＥRLINK＂hｔtｐ：//wｗｗ。ic。ｓunyｓ/Stu／shilin／rnaｉ.ｈtｍl＂httｐ：／／ｗww.ic。ｓuｎysb。edｕ/Ｓｔu／shilin/rｎａｉ.hｔmlﻫHYＰEＲＬＩNK"ｈttp：／/desiｇn.ｄharmａｃon．com／rnadｅｓｉgn/deｆaｕlｔ。aspx?SIＤ=４５３587１0＂ｈtｔｐ://ｄeｓｉ/ｒｎadｅsign/defａｕｌt.aspx？SIＤ＝4５３５8710ﻫ2．ＲＮAi目标序列的选取原则：ﻫ（1）从转录本（ｍＲＮA)的AUＧ起始密码开头，寻找“AA”二连序列,并登记其3’端的1９个碱基序列,作为潜在的ｓｉRNA靶位点。有讨论结果显示ＧC含量在4５％—5５％左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。ﻫＴuscｈl等建议在设计siRNＡ时不要针对５’和3＇端的非编码区（unｔranslatedreｇioｎｓ，ＵTRs），缘由是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mＲＮＡ从而影响ｓiRNA的效果。ﻫ(2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人,或者小鼠,大鼠等等)进行比较,排解那些和其他编码序列/EST同源的序列。ﻫ例如使用BLASＴ(HYＰERＬＩNＫ”httｐ：//wwｗ．ｎｃｂｉ．nｌm.nｉh．ｇoｖ/BLASＴ/"ｗww.ｎcbi．ｎｌｍ。nｉh.gｏv/ＢLASＴ/)

（3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的ｓiＲNA,以找到最有效的sｉＲNA序列。

3．阴性对比ﻫ一个完整的ｓiRNA实验应该有阴性对比,作为阴性对比的ｓiRNA应该和选中的sｉＲＮA序列有相同的组成，但是和mRＮA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的sｉRNA序列打乱,同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性.ﻫ4．目前已证实的sｉRＮA可以在下面的网页找到：ﻫHYＰERＬIＮＫ"http：//ｄｅｓigｎ.ｄhａｒmacon.ｃｏｍ/ｃａｔalｏg／categｏｒy．aspx?kｅy=４9＂hｔtp：//desiｇn．dharmacoｎ．cｏｍ／caｔaｌog/ｃaｔｅgory。ａsｐx？key=４9ﻫHYPＥRLＩＮＫ”ｈｔｔp：//wｗｗ.ａmbｉoｎ。cｏｍ/ｔecｈliｂ/ｔb/ｔｂ_502．html＂http：／/www.ambｉon.coｍ/ｔeｃhlｉb／ｔｂ／ｔb＿502．htmlﻫＨYPＥRLIＮK”htｔp：/／ｗeb．ｍiｔ。edu/ｍmｃｍanuｓ/www／sｉRNＡDB．htｍl"ｈtｔｐ：//ｗeb.mｉt．edｕ／mmcｍａnus/www/siＲＮＡDB。htmlﻫＨYPERＬINＫ”http：/／python．ｐenｇuindｒｅamｓ．ｎet/Oｒdｅr_Enｔｒy/jｓp/BｒoｗseCａｔaｌｏg．ｊｓp?Categoｒｙ＝Pｕbｌisheｄ”ｈttp：／/pｙｔhon．ｐenｇuｉndｒeams.ｎｅt／Orｄer＿Entｒｙ/jsｐ/ＢｒowseCataｌｏg.ｊsｐ？Caｔegorｙ=Ｐuｂｌｉsｈeｄﻫ(二)siRＮA的制备

目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片断dsＲＮAｓ经RＮａsｅIＩＩ类降解(e。g.Diceｒ，Ｅ。coｌi,RNaｓeＩII）体外制备siRNA，以及通过siRＮA表达载体或者病毒载体，PＣR制备的siＲNA表达框在细胞中表达产生siＲNA。体外制备ﻫ1．化学合成ﻫ很多国外公司都可以依据用户要求供应高质量的化学合成ｓｉRＮA。主要的缺点包括价格高，定制周期长,格外是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—４对siＲNＡs的成本就更高了,比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。ﻫ最适用于：已经找到最有效的sｉＲNA的情况下，需要大量sｉRNＡ进行讨论

不适用于：筛选sｉRＮＡ等长时间的讨论,主要缘由是价格因素ﻫ2.体外转录ﻫ以DNAOｌｉgo为模版，通过体外转录合成siRNＡs,成本相对化学合成法而言比较低,而且能够比化学合成法更快的得到ｓiRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能供应足够做数百次转染的ｓiRNAs,但是反应规模和量始终有肯定的限制.而且和化学合成相比，还是需要占用讨论人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的sｉＲＮAｓ毒性小，稳定性好,效率高，只需要化学合成的ｓｉRNA量的1/1０就可以达到化学合成ｓiＲNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。ﻫ最适用于：筛选siRNAs，格外是需要制备多种siＲＮＡｓ，化学合成的价格成为障碍时。ﻫ不适用于：实验需要大量的，一个特定的siＲNＡ.长期讨论。ﻫ3．用RＮaseIII消化长片断双链RＮＡ制备siRNAﻫ其他制备sｉRNＡ的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRＮＡ。而用这种方法—-制备一份混合有各种sｉRNＡｓ“混合鸡尾酒”就可以避开这个缺陷。选择通常是２00-１0０0碱基的靶mRNA模版,用体外转录的方法制备长片断双链dｓRNA，然后用ＲNａｓeＩＩI（ｏrDｉceｒ）在体外消化，得到一种ｓiRＮAs“混合鸡尾酒"。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个sｉＲNA混合物就可以直接转染细胞,方法和单一的ｓｉRNＡ转染一样.由于ｓiRNA混合物中有很多不同的siＲＮAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。

ｄsRＮＡ消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效sｉRNA序列的步骤，为讨论人员节省时间和金钱(注意:通常用RNＡseＩII通常比用Dｉcer要廉价)。不过这种方法的缺点也很明显,就是有可能引发非特异的基因缄默,格外是同源或者是亲密相关的基因。现在多数的讨论显示这种情况通常不会造成影响。ﻫ最适用于：快速而经济地讨论某个基因功能缺失的表型ﻫ不适用于:长时间的讨论项目,或者是需要一个特定的ｓiＲＮA进行讨论,格外是基因治疗体内表达ﻫ前面的３种方法主要都是体外制备siＲNＡｓ，并且需要专门的ＲＮＡ转染试剂将sｉRNAｓ转到细胞内。而采纳sｉRNＡ表达载体和基于PCR的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到sｉＲNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RＮA。ﻫ4.ｓiRＮA表达载体

多数的ｓｉRNＡ表达载体依靠三种RNＡ聚合酶IIＩ启动子（ｐolIＩＩ）中的一种，操纵一段小的发夹RNＡ（shｏrtｈａiｒpiｎRＮＡ，shＲNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟识的人源和鼠源的U６启动子和人H1启动子。之所以采纳RNApoｌIＩＩ启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RＮＡ,而且它是通过添加一串（3到6个）Ｕ来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNＡ序列的DＮA单链,退火,克隆到相应载体的ｐolIII启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。ﻫsｉRＮA表达载体的优点在于可以进行较长期讨论——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久.

病毒载体也可用于siRＮＡ表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因缄默的讨论，避开由于质粒转染效率低而带来的种种不便，而且转染效果更加稳定。ﻫ最适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因缄默.ﻫ不适用于：筛选siRＮA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）.ﻫ5.sｉRＮA表达框架

siRＮＡ表达框架(ｓiＲNAｅxpｒｅsｓｉｏncasseｔtes,SＥＣｓ）是一种由PＣR得到的ｓｉRNＡ表达模版，包括一个RＮＡpoｌIIＩ启动子,一段发夹结构ｓiRNA，一个ＲNＡpolＩIＩ终止位点,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和sｉRNA表达载体不同的是,SＥCs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PＣR得到，不用一天的时间.因此，SECｓ成为筛选siRＮA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的讨论体系中启动子和ｓiRNＡ的最适搭配.如果在PCＲ两端添加酶切位点，那么通过SＥＣs筛选出的最有效的ｓiＲNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNＡ表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siＲＮA和长效抑制的讨论。ﻫ这个方法的主要缺点是①PCＲ产物很难转染到细胞中(晶赛公司的Protoｃｏl可以解决这一问题）②不能进行序列测定，ＰCR和DＮＡ合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不抱负。ﻫ最适用于:筛选siＲＮA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子ﻫ不适用于：长期抑制讨论.（如果克隆到载体后就可以了）ﻫ(三)siＲNA的转染ﻫ将制备好的sｉRNA，siRＮA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种:ﻫ１.磷酸钙共沉淀

将氯化钙，RＮA(或ＤＮA）和磷酸缓冲液混合,沉淀形成包含DNA且微小的不溶的磷酸钙颗粒.磷酸钙－DNＡ复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须当心校准,保证质量,由于甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。ﻫ２.电穿孔法

电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜临时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染格外重要，由于过高的场强和过长的电脉冲时间会不行逆地损害细胞膜而裂解细胞。一般,成功的电穿孔过程都伴随高水平（5０%或更高)的毒性.

3．DＥAE—葡聚糖和polｙbreｎeﻫ带正电的DEAＥ-葡聚糖或ｐoｌybrｅne多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面.通过使用ＤMＳＯ或甘油获得的渗透休克将ＤNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。ＤＥAE－葡聚糖仅限于瞬时转染。ﻫ４．机械法ﻫ转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪(bioliｓｔiｃｐａrtｉcle).显微注射使用一根细针头将DNＡ，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压ｍiｃｒoprojectｉｌe将大分子导入细胞.

5。阳离子脂质体试剂ﻫ在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时,其可以形成微小的（平均大小约１00－４０0nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DＮA—阳离子脂质体复合物.据称,一个约５kb的质粒会结合2—4个脂质体。被俘获的DＮＡ就会被导入培育的细胞。现存对DNＡ转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体.ﻫ为了达到高的转染效率,在转染实验过程中，需要注意以下几点:

１.纯化siＲＮAﻫ在转染前要确认ｓiRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNＡ，推举用玻璃纤维结合，洗脱或通过15—２０％丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的ＲNA通常需要跑胶电泳纯化（即ＰAGE胶纯化）。ﻫ２．避开ＲNA酶污染ﻫ微量的ＲNＡ酶将导致sｉRＮA实验失败。由于实验环境中ＲＮA酶普遍存在，如皮肤，头发，全部徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA酶污染格外重要。

３。健康的细胞培育物和严格的操作确保转染的重复性ﻫ通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推举用5０代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。ﻫ4。避开使用抗生素ﻫAmbiｏn公司推举从细胞种植到转染后７2小时期间避开使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素.有些细胞和转染试剂在ｓiRNA转染时需要无血清的条件.这种情况下，可同时用正常培育基和无血清培育基做对比实验，以得到最佳转染效果。

5。选择合适的转染试剂ﻫ针对sｉＲNA制备方法以及靶细胞类型的不同,选择好的转染试剂和优化的操作对ｓiＲＮA实验的成功至关重要。

６。通过合适的阳性对比优化转染和检测条件ﻫ对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对比。将不同浓度的阳性对比的ｓiRＮA转入靶细胞（同样适合实验靶siRNＡ），转染48小时后统计对比蛋白或ｍRＮA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRＮＡ将导致细胞毒性以至死亡。ﻫ7.通过标记sｉRNA来优化实验ﻫ荧光标记的ｓiRNA能用来分析sｉＲNA稳定性和转染效率.标记的ｓｉＲNA还可用作siＲNA胞内定位及双标记实验(协作标记抗体）来追踪转染过程中导入了ｓiRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。设计siＲNAs的方法关于设计sｉRNA以及siRNＡ设计对siＲNA功能的影响，至今还没有牢靠的规律。虽然我们可以通过对mRＮＡ实验分析精准的找到一段基因的全部sｉRNA最佳作用位置,但这个过程十分耗时且昂贵，不推举常规实验使用.一种做法是每个目标序列设计3—４对siRNAｓ,实验选择较有效的sｉRＮA.ﻫ

ﻫ目前，siRNＡ设计大都依据Tuscｈｌ的实验，要点如下：ﻫ１.目标基