基因克隆的策略及实例分析

第四章基因克隆的策略引言第一节目的基因的获得第二节基因的重组与转移

第三节重组体克隆的筛选和鉴定第四节实例分析基因克隆的策略及实例分析引言

基因克隆的本质是把某一目标DNA片段通过无性的方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体和寄主细胞来实现的。一般而言，基因克隆包括四部分工作：1、目标DNA片段的获得；2、克隆载体的构建；3、寄主细胞的转化；4、重组体克隆的选择和鉴定。

目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为载体的基因克隆体系已经相当的成熟，本章将以这种克隆模式为主体对基因克隆的策略展开讨论和分析。大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案DNA片段的获得载体构建细菌转化重组体的鉴定限制性内切酶消化机械切割双链cDNA的合成化学法直接合成同聚物加尾粘性末端连接平末端连接加接头造成粘性末端重组噬菌体DNA转染重组质粒的转化体外包装进行转导表型鉴定核酸杂交免疫学分析酶切鉴定第一节目的基因的获得一、化学法直接合成基因二、从基因组文库中钓取目的基因三、从cDNA文库中钓取目的基因四、通过PCR直接扩增出目的基因

一基因组DNA片断化（一）限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。1.优点2.缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene（二）随机片断化1.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。①内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。（1）限制性内切酶的选用原则1）4bp的内切酶平均每46（4096）bp一个切点。2）6bp的内切酶平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。（Sau3A—BamHI）2.机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。二

化学合成目的基因（一）目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。①

保护dNTP的5’端P或3’端-OH③

用酸或碱的脱保护（1）原理1.磷酸二酯法②

带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。（2）合成过程下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。2.磷酸三酯法

将第一个核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上。

固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。15合成的二核苷酸连接处有三个酯键！固相磷酸三酯合成过程固相支持物结果是全保护的DNA：5’DMT,3’固相支持物,核苷酸之间对氯苯。最后脱保护固相支持物固相支持物C化学合成的DNA片断一般在200bp以内。（二）、

化学合成DNA片断的组装用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。1.互补连接法预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。（2）5’端磷酸化（1）互补配对（合成的DNA单链的5’端是-OH）T4DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA双链（3）连接酶连成完整双链2.互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。3’

5’

5’

3’

5’

3’

T4DNA连接酶Klenow片段引物1.直接合成基因（三）、

寡聚核苷酸化学合成的优点2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA

3.合成探针序列4.定点突变合成合成带有定点突变的基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低DNA合成仪5.合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor

将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。

理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。（一）、基因文库的构建1.基因文库（genelibrary）三从基因组文库中钓取目的基因（2）目前常用的载体

2.构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求

载体系列：

容量为

24kpcosmid载体：

容量为

50kbYAC：

容量为

1MbBAC:容量为

300kb断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体DNA大片段的制备3.基因文库构建的一般步骤超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。

①

物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。②

酶切法：（2）载体与基因组DNA大片段的连接①

粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。②人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端③同聚物加尾4.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）例如：人的基因组是

3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×1051.cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。2.cDNAlibrary四、从cDNA文库中钓取目的基因mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反转录酶引物利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。4.构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（totalRNA）提取3.cDNA文库的特点提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。

利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化①原理②mRNA的分离纯化Column（柱）反转录酶（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。

mRNAcDNA3’

5’

5’

AAAAAAATTTTTTTOligodT引物用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’

3’

5’

5’

引物cDNA第一链3’

5’

引物②

降解mRNA模板或RNaseH碱剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。cDNA第一链5’

cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’

3’

③cDNA第二链合成④去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链cDNA第二链5’

3’

cDNA第一链cDNA第二链5’

3’

5’

3’

在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。5.cDNA与载体连接：接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶6.cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N：所需的重组载体数（克隆数）1n1n文库的查询（screening）用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southernblot杂交。文库载体探针电泳后杂交放射自显影测序分析五、PCR扩增获得目的基因1.直接从基因组中扩增（1）提取基因组DNA作模板（2）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增真核生物基因组含有内含子！适合扩增原核生物基因。原核基因组部分原核细胞提取基因组DNAPCR扩增（1）提取基因组

totalRNA（2）反转录合成总cDNA作模板（4）PCR扩增（3）根据目的基因序列设计引物2.从mRNA中扩增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。适合扩增真核生物基因。目的基因的引物1反转录成目的基因cDNA第一链目的基因的引物2目的

基因cDNA第二链PCRmRNA克隆外源基因外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞第二节

基因的重组与转移

（一）、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。一

DNA片段的体外连接1.两段DNA的连接依靠粘性末端2.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端ligasenick（二）、齐平末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1.直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’

3’

-OH-PP-HO-5’

3’

1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾

法

2.人工加尾形成

“粘性末端”

DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物(linker)连接①linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用

④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:③优点：（3）DNA接头

(adapter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。②adapter的作用Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’

5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’

接头自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。③优点：连上后就能用。④缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我连接5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-PP-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’

接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’

CIP处理-OHHO-Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG5’

5’GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC5’

缺口缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。1.与T载体直接连接（1）PCR产物两个3’端一般都有一个ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T利用TaqDNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！（三）、PCR产物的连接AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATA2.在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3’端15~20bp与模板互补；5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。（5’端多余的3~5bp属保护碱基）避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。引物1GCAGAATTC

互补序列模板EcoRI位点5’--3’

GCAGAATTC

互补序列5’--3’

3’

模板GCAGAATTC

互补序列

PCR产物5’--3’

3’

复性延伸模板模板3’

3’

GCTAGCCGG

互补序列模板BamHI位点-5’

3-’

5’

复性延伸模板模板3’

3’

GCTAGCCGG

互补序列-5’

3’-模板5’

GCTAGCCGG

PCR产物

互补序列-5’

3’-引物2带酶切位点的PCR产物GCAGAATTC

PCR产物5’--3’

GCTAGCCGG

PCR产物-5’

3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点BamHI位点AATTC

PCR产物5’--3’

GCTAG

PCR产物-5’

3’-GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！（四）、DNA体外连接应注意的事项插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。2.DNA插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTCT重组但移码突变！4.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。5’

3’

载体插入片断1.载体自身环化连接（能存活）2.载体之间互相连接（能存活）3.插入片段互相连接（不能存活）4.一个载体与几个插入片段重组（能存活）（五）、载体和外源DNA插入片段的连接结果5.几个载体与一个插入片段重组（能存活）1.目的增加受体菌细胞膜的通透性。二

重组体导入细菌细胞（一）、感受态大肠杆菌的制备使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2.菌种用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理4.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬（二）、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染（transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。1.外源DNA导入细菌的几种方法（3）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。每

gDNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法

2.转化率简单，但转化效率不高（106-108/

gDNA）。（1）热休克法（heatshock）转化效率高（高于109/

gDNA）。（2）电转化法10ng载体DNA100

L感受态菌Onice混合，静置10分钟42ºC1分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100

L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法4.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬（二）、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染（transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。1.外源DNA导入细菌的几种方法（3）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。每

gDNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法

2.转化率简单，但转化效率不高（106-108/

gDNA）。（1）热休克法（heatshock）转化效率高（高于109/

gDNA）。（2）电转化法10ng载体DNA100

L感受态菌Onice混合，静置10分钟42ºC1分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100

L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300

L

电转仪调为2.5kV,25

F

脉冲控制器200-400

0.5

g质粒DNA

Onice混合加入1mLSOC培养液37°C中速震荡60分钟10-100

L转化液涂含抗菌素的平板转化（2）电转化法4.平板培养基培养细菌10-100

L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜环形重组质粒质粒自我连接线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。①环形质粒数（1）重组质粒

5.影响转化率的因素①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。④储存感受态菌要在-70℃以下③CaCl2处理⑤使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞

（competentcells)把重组的噬菌体

DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的

噬菌体颗粒。6.体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（invitropackaging）

（2）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的

DNA接受器位点（receptorsite)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，

DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857基因突变的

噬菌体

但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。cI857其它基因溶源状态（

DNA不转录、不翻译）

DNA阻遏蛋白阻遏蛋白44℃—45℃

DNA转录、翻译合成外壳蛋白32℃

噬菌体1外壳蛋白基因E发生了突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突变的

噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型

噬菌体。（4）

互补型噬菌体

外壳蛋白基因D发生了突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。

噬菌体2(5)体外包装过程

体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每

g

DNA能形成106噬菌斑）。（6）

转导

转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。三

外源基因导入真核细胞（一）、导入酵母细胞1.菌株选择如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his3

1（1）利用原生质球进行转化2.酵母的转化方法

酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母载体PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。

转化

酵母0.1mol/LLiCl处理插入外源基因的酵母载体感受态40%PEG4000（2）利用Li+盐进行转化叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗（二）、导入植物细胞1.叶盘法（leafdisk)植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液1-2kV,3-25

F电击愈伤组织幼苗分化2.电击法（electroporation)又称高速微型子弹射击法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2

m钨弹头吸附特制手枪射击植物装入3.基因枪法（genegun）4.农杆菌（agrobacterium）介导（详见另外章节）（1）原理：（三）、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。不需要载体。（2）特点：脂质体有商业试剂盒（如LifeTechnologies）。2.脂质体（lipofectin）载体法脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。3.显微注射法(microinjection)二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。4.DEAE葡萄糖传染法葡聚糖葡聚糖+DNA吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。DEAE-dextran细胞外源DNA预处理摄入DEAE-dextran外源DNA细胞混合DEAE-dextran对细胞有毒!5.病毒（virus）介导（详见另外章节）外源基因导入细胞的方法18第三节

重组体克隆的筛选和鉴定（一）、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。

Tetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI。一

载体表型选择法1.原理：pBR322（1）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：2.pBR322抗菌素标记选择产生

-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：3.选择过程：如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。（二）、

-半乳糖苷酶显色反应选择法

-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝++深蓝色1.原理：载体上有一段

-半乳糖苷酶基因（LacZ）的

片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的

-半乳糖苷酶基因（

片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的

-半乳糖苷酶。假阳性：如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码；（不破坏

肽）。2.选择过程

-半乳糖苷酶使Xgal分解成蓝色产物。利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。（一）、原理：二

根据插入基因的表型选择1.弥补缺陷his-his+受体菌：外源基因：在不含组氨酸的培养基中生长小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。DHFR载体连接转化受体菌三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板含DHFR的克隆才能生长例：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2.增加新性状利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。（一）、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。三

DNA电泳检测法

分子量Marker载体重组克隆（二）、酶切电泳筛选法1.原理：根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。ABA或B不同克隆的酶切结果筛选过程（三）、PCR扩增检测法1.原理PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。2.过程（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。（3）电泳PCR产物。（4）检查是否有PCR产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。1.核酸杂交四

核酸杂交检测法

（一）、原理：重组克隆与探针杂交。3.识别标记32P或

125I。（1）放射性同位素2.检测用的探针与外源DNA插入片断互补的序列。（2）非放射性标记荧光素（二）、核酸杂交检测方法用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。1.Southernblotting从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。酶切前酶切后插入片断载体Southernblot筛选结果（1）原位杂交筛选特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。（2）R-环检测法DNA-RNA杂交。1）原理：2）选择过程在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。用外源基因的mRNA与重组载体杂交。缺点：需要电镜！2.Northernblotting用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。主要检测插入片断是否被转录。从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：（一）、放射性抗体检测法五

免疫化学检测法

1.抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交”

待测基因产物蛋白一抗二抗125I标记的二抗结合蛋白固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗125I标记的二抗固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗固相支持滤膜固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗二抗125I标记的二抗结合蛋白125I标记的二抗2.放射性抗体检测法过程3.Broome-Gilbert双位点检测法质粒基因A插入基因B表达质粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白检测融合蛋白。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。固相支持滤膜抗A抗体125I标记的抗B抗体质粒蛋白A外源蛋白B质粒蛋白A外源蛋白B固相支持滤膜抗A抗体发光，底片曝光（二）、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。1.原理抗原——抗体凝集反应。检测分泌型产物。2.方法对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。（三）、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linkedimmunosorbantassay1.原理：一抗（primaryantibody）:

与目标分子的特异结合。二抗（secondaryantibody）：

与一抗的特异性结合。酶连（enzyme-linke）：

二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。待测基因产物蛋白一抗二抗酶

待测基因产物蛋白一抗二抗无色的底物有色的产物比色观察酶

2.ELISA检测的一般步骤（1）固定样品将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。孔底加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。（2）一抗结合一抗加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。（3）二抗结合二抗加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。（4）显色反应在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。（5）比色3.ELISA的局限性有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。必须与其他方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（monoclonalantibody）临床检验常用的单抗（四）、免疫印迹（westernblotting）法1.原理：在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。①SDS:（SDS）：②聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。电泳buffer电泳buffer点样电泳方向③蛋白质电泳的分子量标准已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。商品化供应Da道尔顿(质量单位,等于一氧原子质量的十六分之一。一克约为6×1023道尔顿DaltonSDSPAGE④凝胶中的蛋白质染色：考马斯亮蓝：灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可褪色回收。

硝酸银：灵敏度高、可检出2-5ng/带。2）转到膜上进行染色。1）直接染色直接染色电泳结果（2）Westernblotting电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。①Western（转膜）胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。膜胶蛋白