免疫学技术和临床

免疫学技术和临床美国贝克曼库尔特公司免疫产品市场部洪军

2007.4安徽内容摘要什么是免疫分析的表现免疫分析的基本概念如何去设计一个免疫分析试剂免疫分析对临床意义的改变Access2介绍什么是免疫分析的表现免疫检测的分析表现准确性精密度灵敏度特异性检测线性范围试剂稳定性定标周期开瓶效期免疫分析检测的临床表现临床灵敏度和特异性是分析结果准确性的临床表现:理想状态健康人群疾病人群灵敏度100%特异性~60%特异性100%灵敏度~50%灵敏度增加特异性增加假阴性假阳性Cut-off设置cutoff值在此处用于筛查分析设置cutoff值在此处减少错误诊断带来的高花费设置cutoff值在此处为了最少化错误结果关于分析试剂的检测灵敏度的定义分析及功能灵敏度分析灵敏度(AnalyticalSensitivity)使用A点标准品分析内的测试最低可辨别0值的功能分析试剂的理论上的极限功能灵敏度(FunctionalSensitivity)一系列不同浓度的标准品分析间的测试,用<20%的CV值来分用来描述分析的临床表现用人血清分析多于20天,且用多个试剂批号和仪器分析表现特点:

正常人群参考值和10%CV（功能灵敏度）免疫分析的基本概念免疫分析的经典定义免疫分析（Immunoassay）

是一种技术用于检测和/或定量

Y抗体（Antibody）通过一个特殊的只能和被分析物结合的抗体抗原（Antigen）免疫学测定的中心问题作为免疫反应，抗原抗体的选择是整个免疫分析特异性和总体表现的关键如何选择好一个抗体去检测一个被检物质，而不与非常相似结构的其它物质有交叉反应，或漏掉须反应的物质，这是分析设计的重中之重抗体的量必须恰当，过多会引起复合物的溶解关于抗体的亲合力抗体除了要求纯度外（单价特异性）还必须要求亲合力，效价指抗体的量，亲合力指抗体的质在非竞争免疫反应的模式中抗体亲和力比标记物的最低检测极限更能影响分析的灵敏度在竞争法免疫反应的模式中抗体亲和力直接关系到竞争的结果对于样品中的干扰物质,亲合力影响分析的抗干扰的能力免疫分析的工作定义免疫分析(Immunoassay)

是一种测试方式,使用特殊的抗体与被检测物质的结合,此被检测物质不能通过简单的化学方法所容易检测到的.

通常在检测系统中会使用到一种叫标记物（labeling）的物质,常标记在抗体上通常会有一个分离（separation）的过程在最后读取信号前总是需要去仔细关注一下分析的模式（format）

Access的技术免疫分析-“what”检测技术–化学发光

分离技术–磁性颗粒

分析模式–灵活

-“how”}分析模式检测技术分离技术检测技术免疫分析检测技术(Detection)–有许多可用的方法

应用一些“标记物”所产生的一些能量进行测定标记物可以或可以不被激活而产生能量通过一些相应的检测器对标记物产生的能量进行测定分离技术分析模式

放射免疫分析(Radioimmunoassay)优势优秀的灵敏度较宽的检测线性范围局限性标记物的半衰期短试剂效期短检测结果的重现性差每次检测都要做标准曲线分析的反应时间长，半天~2天发射性污染有害很难实现自动化检测荧光荧光素(Fluorophores)–FIA，DELFIA原理荧光底物,4-MUP，或荧光标记物，镧系元素Eu3+,Tb3+,Sm3+吸收光为一个短波长的光，而发射光为一个长波长的光通过荧光计检测优势与RIA具有相似的灵敏度和检测线性范围避免了RIA对危害污染物处理的麻烦和半衰期短的问题局限性可能会有来自样品中的一些自身荧光物质或短寿命的荧光物质的干扰需用空白对照，速率法或延迟读数来克服酶-颜色的变化酶(Enzymes)-EIA

原理在免疫分析结束后通过催化所加入的酶底物典型的催化反应包括颜色的变化,用分光光度计进行检测优势非常容易使用的技术用于一些定性的分析局限性对定量分析所要求的灵敏度和宽线性难以实现ELISA技术必须每次定标试剂部分成分要复溶重组反应时间较长化学发光化学发光物质-CLEIA

原理不稳定的分子通过加入一些化学基团变得很稳定,而移去这些起稳定作用的化学基团后,分子结构变得不稳定发出光（pH的改变，酶切作用，电激发等）优势–具备RIA所拥有的优势(灵敏度和宽线性),但排除其缺点用一个简单的光度计读数非常低的背景干扰类型–闪烁(flash),持续(glow)发光发光物质的稳定性水溶液中的稳定性化学发光物质AMPPD,Dioxetane(Lumi-Phos530TM)-最稳定的化学发光物质（第三代）第一代：鲁米那第二代：丫啶酯类，三联吡啶钌代表性分析系统贝克曼库尔特-Access/Access2/DxI800终点读数,更稳定RLU00510

时间(分钟)5560ACCESS化学发光标记物的特点很宽的检测线性范围可检测到6个数量级(例如:1-100,000units)

极高的灵敏度可检测到小到10-21摩尔/升

很底的背景干扰对于一些超敏分析项目,有相当接近零值的背景信号

更超强的试剂稳定性试剂效期开瓶效期定标周期分离技术免疫分析检测技术分离技术(Separation)–有很多方式典型的是,特异性结合的分析物被保留而未结合物质和无用的反应物被清除

分析模式

技术的创新微粒子包被珠包被微孔包被管包被磁颗粒包被技术磁颗粒抗体包被技术磁颗粒均匀的悬浮于整个反应体系分析物在磁颗粒表面捕获磁颗粒在磁场中被清洗磁颗粒重新悬浮十分容易

优势快速的反应动力学较少的样品量提高检测的灵敏度极好的批内重显性可以探针取放，实现自动化分析模式免疫分析检测技术分离技术

分析模式-有很多种方式可定义为分析的

“处方”设定一个最优化的模式(可变量)去最优化项目的临床应用

分析模式可变量夹心法(Sandwich)vs.竞争法(competitive)标记物的放置同步(Simultaneous)vs.分步(sequential)试剂/样品加入的顺序孵育的次数(步骤)清洗分离的次数(步骤)试剂/样品的体积/浓度孵育的时间孵育的温度Access的分析模式基本分析模式夹心法(Sandwich)竞争结合(Competitivebinding)试剂的加入，孵育和清洗

同步(Simultaneous)(1步,1次清洗)分步(Sequential)(2步,2次清洗)“Piggyback”(2步,1次清洗)夹心法分析模式捕捉抗体(Captureantibody)和标记抗体(labeledantibody)每个不同的抗体可以针对不同的抗原决定簇，或二个在同一个抗原决定簇分析更特异因为二个抗体同时反应适合于检测大分子物质

bhCG TSH IgE ProlactinFSH LH Ferritin HBsAg竞争法分析模式只有捕捉抗体

主要针对小分子物质检测

没有足够表面积的分析物去符合“夹心法”要求T3 FT3B12DigoxinProgesteroneT4FT4FolateCortisol Estradiol如何去设计一个免疫分析试剂一个免疫分析项目的诞生里程碑(Milestones)

市场调研确定需求项目的详细特点要求确定分析模式研发和优化证明分析表现符合项目的详细特点要求(betasites,clinicalstudies)提交注册项目临床应用的要求临床应用(claims)筛查（Screening）检测（Detection）诊断（Diagnosis）分层（Staging）预后（Prognosis）监测（Monitoring）项目的临床应用与分析表现必须到达的分析表现特征灵敏度（Sensitivity）特异性（Specificity）精密度（Precision）线性范围（Dynamicrange）其它分析模式的选择需考虑的因素

分析物的特征体积（竞争法还是夹心法）浓度（一步法，二步法，反应时间等）潜在的“钩状效应”（hookeffect）-假阴性解决的方法可以使用2步法模式样品量和试剂量的平衡抗干扰能力仪器的能力／局限性预处理的要求试剂原材料的选择原材料

抗体标准品封闭试剂（稀释液）清洗缓冲液YYYYY抗体的选择单克隆(Monoclonal)和多克隆(polyclonal)

选择的标准(criteria)特异性(Specificity)灵敏度(Sensitivity)供应能力(Supply)相关性(Correlation)可制造性(Manufacturability)花费(Cost)多克隆抗体(PolyclonalAntibodies)免疫动物获得,如羊或兔

时间长,复杂的制作流程注射,监测滴度(可能反复注射)周期性的抽血获得特征化(Characterization)和纯化(purification