高效液相色谱在食品分析中的应用

高效液相色谱在食品分析中的应用

高效液相色谱法（hplc）也称为高效液相色谱法。根据经典的液相色谱法，在20世纪60年代末引入了气相色谱法，并迅速发展。HPLC分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高,能分析高沸点,但不能气化热不稳定的生理活性物质,基于这些特性被广泛应用于食品检测领域。我国食品的发展历史悠久,社会经济迅速发展,人民生活水平不断提高,食品安全成为人们极为关注的话题,尤其是近年来食品安全事件频频发生,人们更加强了对食品的安全意识,这就要求食品分析技术更加高效准确。HPLC在我国食品分析领域的应用始于20世纪70年代末,90年代后期国家标准中开始将HPLC法列为检测食品中的污染物、营养成分、添加剂、毒素和无机成分等的国标方法。笔者主要概述了HPLC在食品分析领域的应用。1延长食品保藏期食品添加剂可以提高食品质量和营养价值,改善食品感观性质,防止食品腐败变质,延长食品保藏期等。目前,我国有20多类、近1000种食品添加剂,合理使用添加剂对人体健康以及食品都是有益无害的,但如果不加以限制使用,对人体健康会产生危害。1.1定性定量测定甜味剂是指能够赋予食品甜味的食品添加剂。按其营养价值可分为营养型与非营养型甜味剂,通常所讲的甜味剂系指人工合成的非营养型甜味剂,如糖精钠、环己氨基磺酸钠(甜蜜素)、乙酰磺胺酸钾(安塞蜜)和天冬酰苯丙氨甲酯(甜味素和阿斯巴甜)等。目前,糖精钠价格低廉,应用广泛,但过量添加会损害人的健康。丁芳林等采用液相色谱-气相色谱联用技术,SpherigelC18色谱柱,电喷雾负离子采集模式,甲醇-甲酸-三乙胺缓冲盐梯度洗脱,定量测定果冻等食品中安赛蜜、糖精钠和甜蜜素含量,结果加样回收率为93.19%~100.90%,相关标准偏差(RSD)为1.05%~2.04%。该方法选择性好,定性定量准确,分析时间短,同时也适用于饮料等其他食品的定性定量检测。王敏等采用次氯酸钠在酸性条件下将甜蜜素转化为氯基环己烷,正己烷萃取,用ODS-C18柱,乙腈∶水=70∶30(V/V)为流动相,于波长314nm处紫外检测,采用外标法定量测定。这不仅可大大减少一些样品中复杂基质的干扰,而且测定限低。对于固体样品,最低检出限可达2.0mg/kg;对于干扰少的液体样品,最低检出限为0.5mg/L,回收率在70%~110%。费贤明等用高效液相色谱-荧光法(HPLC-FLD)测定了食品中的糖精钠,最低检出限在0.005~0.200mg/ml,与高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)相比较,HPLC-FLD法重现性好,准确度更高,由于FLD的选择性响应,降低了对色谱柱的性能要求,更适合复杂样品的快速分析,使其具有比UV法更高的可靠性,是一种较为理想的糖精钠检测方法。1.2防腐苯甲酸和山梨酸含量的测定常用的防腐剂有苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钠盐等,因其具有毒性小的特点,故国标法中允许一部分食品中加入少量的防腐剂。但防腐剂的富集对人体机能会产生一定的影响,所以食品中防腐剂含量的测定显得非常重要。王静等建立了同时测定食品中山梨酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯HPLC法。采用Diamonsi1-ODS色谱柱,以乙腈、水(磷酸调pH值为3)、四氢呋喃为流动相梯度洗脱,于波长254nm处紫外检测,7种防腐剂可以达到基线分离,加样回收率为93.3%~100.5%,最低检出限在0.025~0.500μg。刘二东等研究利用HPLC测定含乳饮料中苯甲酸的含量。用Zn(Ac)2和KFe(CN)3溶液作为沉淀剂进行样品的预处理,磷酸盐缓冲液和甲醇混合溶液为流动相,C18色谱柱,于波长225nm处紫外检测,方法简单快速、灵敏度高,既适用于大部分含乳饮料,也适用于纯牛奶的测定。苏爱梅采用加沉淀剂沉淀法对火腿肠样品进行预处理,过滤后用RP-HPLC法测定火腿肠中防腐剂苯甲酸和山梨酸的含量。色谱柱为Symetry-C18,以0.02mol/L乙酸铵-甲醇(97∶3)为流动相,检测波长为230nm。苯甲酸和山梨酸浓度在0~0.05g/L范围内线性很好(r=0.9996);山梨酸最低检出限为0.024g/L,平均回收率为100.4%,RSD为0.68%。1.3聚酰胺反应及红乳酸检测目前已经公认人工合成食用色素应逐步限制使用,但值得注意的是,在我国至今仍有少数不法商人,超标准使用人工合成食用色素,甚至利用不能用作食品添加剂的染料,严重地危害了人们的健康。张连龙等采用HPLC法测定保健食品黄金搭档包衣片中食用合成色素,样品前处理用粉碎提取法和漂洗法,聚酰胺吸附纯化LichrospherC18柱,甲醇-乙酸铵流动相梯度洗脱,单波长或多波长测定柠檬黄、靛蓝和诱惑红3种色素。其线性范围宽(0~100g/ml),回收率高(91.3%~103.1%),重现性好(RSD=2.11%~5.63%),最低检出限为2~11ng。其中,尤以粉碎提取法,梯度洗脱,多波长检测效果更佳。宋伟华等建立了凝胶色谱净化、HPLC法检测红腐乳等含油及着色食品中苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的方法。用正己烷或乙酸乙醋∶环己烷=1∶1(V/V)提取食品中的苏丹红,经凝胶色谱(GPC)去除样品中分子量较大的油脂天然色素等干扰物后,用HPLC检测。王华等以HPLC法对不同产地赤霞珠干红葡萄酒中花色素苷的组分进行了研究,为科学客观地鉴定葡萄酒原料品种和其他相关的研究提供了依据,同时也为建立葡萄与葡萄酒花色素HPLC指纹图谱提供了依据。1.4降压药固相食品抗氧化剂是能阻止或延缓食品氧化变质、提高食品稳定性和延长贮存期的食品添加剂,添加在食品中的抗氧化剂必须用量得当,否则会对人体造成危害。申世刚等采用RP-HPLC法测定油炸薯条没食子酸内酯(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、羟基茴香醚(BHA)、4-已基间苯二酚(4HR)、二丁基羟基甲苯和2246含量。其中,PG、TBHQ用50%甲醇(RP-HPLC体积分数1%的冰醋酸)作流动相,BHA、4HR、BHT和2246用80%甲醇作流动相,检测波长为280nm,相关系数在0.9983~0.9996,最低检出限为1.0~2.0μg/g,平均回收率均在85%以上。刘宏程等采用基质固相分散萃取植物油中抗氧化剂BHA、BHT、TBHQ和PG,经HPLC法进行分离。结果通过基质固相分散技术,可减少有机溶剂的用量,缩短分析时间,提高分析效率,回收率为85.8%~94.3%,最低检出限为2ng。俞哗等采用乙腈提取食用油脂中的抗氧化剂PG、THBP、TBHQ、NDGA、BHA、OG、IONOX-100、DG和BHT,浓缩后用RP-HPLC法同时测定其含量,方法最低检出限:PG、THBP、NDGA、OG和DG为0.5μg/g,TBHQ、BHA、IONOX-100和BHT为1.0μg/g。2hplc在食品中的应用2.1hplc法检测麦芽糖含量对于碳水化合物的测定,HPLC法操作简便,灵敏度高,可同时测定各种糖,国际上已将HPLC法作为酒类糖分含量测定的仲裁法。林婧烨等采用高效液相色谱-蒸发光散射测定龙眼果中水溶性单糖和寡糖组分的种类和含量,采用HypersilNH柱,乙腈∶水=80∶20(V/V)为流动相,蒸发光散射法检测,分离鉴定的果糖、葡萄糖和蔗糖在25~1000μg/ml范围内与色谱峰面积有良好的线性关系,标准品回收率在97%~106%。张雪荣等建立了测定麦芽糖含量的HPLC法,色谱柱为Alhima氨基柱,流动相为乙腈-水(62∶38,V/V),麦芽糖峰与杂质峰的分离度为6.09,精密度试验的RSD为0.90%。该法测定麦芽糖含量具有简捷、实用、准确等特点。Bernaardez等用HPLC法测定了不同种类栗子中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量。首先将样品冷冻干燥,在体积比为80%的水醇溶液中用超声波提取糖类,蔗糖的回收率为86%,种类不同的栗子蔗糖含量不同,范围在65~195g/kg。2.2柱前衍生rp-hplc法氨基酸是生物体中重要的生命物质,是组成酶和蛋白质的基本单元,准确灵敏地测定食物中氨基酸的含量具有十分重要的意义。目前,柱前衍生化高效液相色谱法以其灵活和易于推广的特点,逐渐取代了传统的茚三酮方法,用以检测氨基酸。陈悦娇等选用OPA柱前衍生RP-HPLC法测定豆浆中的游离氨基酸,采用EclipseXDB-C18反相柱,甲醇和0.05mol/L醋酸钠线性梯度洗脱,于波长338nm处紫外检测,豆浆煮制过程中游离氨基酸含量逐步增加,回收率在90.86%~106.05%,各氨基酸都得到了良好的分离。刘霄玲采用柱前衍生法,用C18反相色谱柱分离试样,经HPLC测定乳制品中16种氨基酸的含量,结果表明,该方法操作简便,重现性好,色谱分离时间短且分离度好。郑昕等采用邻苯二甲醛(OPA)-9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)进行氨基酸柱前衍生,RP-HPLC法测定氨基酸含量。3个不同浓度梯度的氨基酸标准溶液线性关系良好,样品保留时间绝对误差小于0.1min,重现性RSD值低于4%,加标回收率均在90%~110%。2.3添加量和分离物的质谱质量脂肪酸是指一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链,是有机物。饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸和三脂酰苷油磷脂卵磷脂等,对人体的健康起到了重要的作用。李国琛等建立了一种用HPLC法与基质辅助激光解吸电离飞行时间(MAIDI-IDI-TOF技术联用分析了蛋黄中磷脂粗提物。将从蛋黄中提取的多种磷脂通过HPLC预先分离,收集各组分后分别进行MALDI-TOF-MS分析得到比较清晰的质谱图。Makahleh等选用RP-HPLC与电容耦合非接触电导检测(C4D)结合的方法分离测定肉蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸与亚油酸5种未衍生化长链脂肪酸,采用HypersilODSC18色谱柱,以甲醇-1mmol/L醋酸钠(78∶22,V/V)为流动相,结果表明,硬脂酸在5~200μg/ml范围内与峰面积线性关系良好,其他4种酸线性范围为2~200μg/ml。将此种方法用于检测南瓜、大豆、米糠及棕榈油中脂肪酸,与标准气相色谱检测方法相比,简单、快速、灵敏度高。2.4线性范围和检出限维生素是维持人体生命活动必需的一类有机物质,也是保持人体健康的重要活性物质,如果长期缺乏某种维生素,就会引起生理机能障碍而发生某种疾病。一般由食物中取得。闰龙宝等建立了婴幼儿配方奶粉中Vc的HPLC法。采用C18反相色谱柱,流动相为甲醇∶6.8g/LKH2PO4水溶液,用盐酸调pH值2.3)=1∶99(V/V),检测波长为215nm。方法的最低检出限为50g,线性范围为20~200μg/ml,加标回收率为80.4%~86.2%。刘必成等建立了测定黄豆饼粉中B族维生素的RP-HPLC法。采用C18柱,甲醇∶水(含5mmol/LPIC-B6和1%冰醋酸,三乙胺调pH值3.2)=30∶70(V/V)为流动相,于波长275nm处紫外检测,苯甲酸为内标物,VB1、VB2、VB6和VB11的平均回收率为99.35%~100.03%,RSD为0.42%~1.08%。3hplc食品污染物的应用3.1回收率、精密度和定量下限农药残留是由于使用农药而导致的在食品、农产品或动物饲料中残留的一定物质,国家相关标准都有明确的药物最大残留量,超过其值有可能对人体造成危害。李海飞等运用HPLC柱后衍生荧光检测法,测定苹果、梨、桃、葡萄、香蕉和芒果等水果样品中涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、三羟基克百威、涕灭威、克百威和甲萘威7种氨基甲酸酯类农药的残留量,结果7种农药3种不同浓度平均添加回收率在72.5%~116.2%,最低检出限为0.0037~0.0074mg/kg。陈辉华等建立了同时检测水产品中四环素类和氟喹诺酮类兽药多残留的HPLC法。样品经固相萃取小柱净化,以甲醇-丙二酸+氯化镁水溶液梯度洗脱,紫外检测器检测。对样品前处理和色谱分析条件进行了优化,8种抗生素(土霉素、四环素、金霉素、沙拉沙星、恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、单诺沙星)在0.1~10.0mg/L范围内与峰面积线性关系良好,最低检出限(S/N=3)为0.011~0.051mg/kg,定量下限(S/N=10)为0.035~0.170mg/kg,平均加标回收率为81.0%~96.0%。此外,西维因、多菌灵和狄氏剂等150多种农药都可以用HPLC法进行分离或分析,在啤酒中时有发现的致癌性很强的亚硝胺类化合物,利用Warters公司开发的SppakSilica小柱净化、浓缩样品、反相色谱法也能快速、准确地检测。3.2方法的检出限和测定下限环境污染物以及在工业生产中所产生的有毒有害化学物,如包装材料等均可通过植物或动物进入食物链,并引起人类的疾病或健康问题。董新艳等建立了一步式氧化铝柱色谱富集结合HPLC-FLD分析检测法,对3种天然VE中的高分子量多环芳烃(PAHS)进行分析测定。样品通过中性氧化铝柱色谱富集净化后,XDB-C18反相色谱柱,乙睛∶水(80∶20,V/V)为流动相进行分离,8种高分子量多环芳烃的最低检出限在0.05~0.45ng/g,定量限范围为0.18~1.50ng/g。Teng等采用液相-电喷雾质谱(ESI/MS)联用技术对水样中全氟辛烷磺酰基化合物(PFOS)和全氟辛烷(PFOA)进行了检测,水样经过固相萃取柱(SPE)后,用HPLC/ESI-MS分析,结果PFOS及PFOA最低检测限分别为0.50、2.00ng/L,回收率分别为88%、75%。3.3测定组化和测定检测食品中存在多种霉菌毒素,主要的霉菌毒素有黄曲霉毒素、镰刀菌毒素和玉米赤霉烯酮等。粮食及食品由于霉变不仅会造成经济损失,有些还会造成误食人畜急性或慢性中毒,甚至导致癌症。程树峰等建立了一种快速检测粮食中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的碘柱前衍生-高效液相色谱法。样品经提取液处理后,加入适量碘衍生剂衍生,衍生后进行色谱分析,结果4种黄曲霉毒