有氧运动对氨基酸类神经免疫活性的影响

有氧运动对氨基酸类神经免疫活性的影响

氨基乙酸钠（glu）-是中枢神经系统中的一个重要的刺激性和抑制性神经流激物。大量神经解剖学研究证实,Glu能神经和GABA能神经广泛分布于心血管自主神经调节环路中,是调节机体循环、呼吸和内分泌功能的重要结构基础。长期有规律的运动训练可使心血管自主神经平衡状态发生改变,总体表现为安静状态的心交感神经张力下降,心迷走神经张力升高,但是,这种改变的中枢机制不清。目前,尚缺乏心血管自主神经中枢内各神经核团对长期运动应激产生应答反应方面的相关研究报道,尤其是针对长期运动训练调节自主神经中枢各神经核团内Glu能神经和GABA能神经的研究更少,仅见于美国JefferyMKramer所在课题组以自发性高血压大鼠为研究对象的一项研究。基于此,本研究以正常雄性SD大鼠为研究对象,随机分为8周中等强度游泳运动组和安静对照组。应用免疫组织化学技术观察自主神经中枢各神经核团(下丘脑室旁核、孤束核、疑核、延髓头端腹外侧核、延髓尾端腹外侧核、胸3脊髓灰质中间外侧柱)内Glu和GABA阳性产物的表达情况,以氨基酸自动分析仪检测脑脊液中氨基酸类神经递质含量。通过比较运动组和对照组大鼠上述指标的差异,分析长期参加有氧运动对心血管自主神经中枢的影响,探讨自主神经平衡状态发生改变的中枢机制。1试验对象和方法1.1动物、饲料与饲养健康雄性Sprague-Dawley大鼠30只,两月龄,体重183～214g。动物合格证号0050484,动物级别SPF/VAF(北京维通利华实验动物技术有限公司)。分笼饲养,每笼5只;国家标准鼠类干燥饲料喂养,自由进食进水;自然昼夜节律光照,动物室内温度22℃～29℃,相对湿度55%～65%。1.2实验方法1.2.1运动及游泳训练大鼠在动物房适应性饲养3天后,按体重排序进行编号,随机分为8周有氧运动组(简称运动组)和安静对照(简称对照组)(表1)。对照组:正常笼内生活,不施加运动干预。在运动组每日训练的同时,对照组大鼠下水浸湿后即捞出,吹干。运动组:游泳池水面面积1.13m2,水深60cm,水温33℃±2℃,每个游泳池分配5只大鼠。游泳训练共持续8周,每周训练6天,休息1天。训练分3个阶段进行:1)第1周为适应性训练,每天逐渐增加游泳时间,使第1周末游泳时间达到1h,第2～3周每天游泳1h;2)第4～5周每天游泳1.5h;3)第6～8周每天游泳2h。1.2.2gaba包膜分析1.2.2.pbs的制作为避免急性运动的影响,在末次训练结束后24h取材,运动组和对照组交替进行。大鼠用3%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉,于胸骨剑突处开胸,左心室插管至升主动脉,用300ml生理盐水(37℃左右)快速冲洗,直至流出液体变清为止。继之灌入4%多聚甲醛(0.1mol/L的PBS配制,pH7.4)500ml,先快后慢(灌流时间在30～45min)。灌注结束后立即取脑和脊髓,分离出下丘脑前部(视交叉和灰结节之间)、延髓、脊髓T3节段,置于4%多聚甲醛PBS溶液中,4℃后固定2h,然后移入20%蔗糖PBS溶液(pH7.2～7.4)中,4℃保存过夜,至组织下沉。冰冻切片机在-20℃(恒温)条件下进行冠状切片,每隔3张取1张,切片厚度为30μm,依次分成3套,1～2套分别进行Glu和GABA的SABC免疫组化染色,第3套做免疫组化对照实验。1.2.2.高效液相色谱法glu、gaba1.切片用30%过氧化氢孵育10min,消除内源性过氧化物酶的活性,PBS洗涤3次。2.滴加试剂A(5%正常山羊血清,PBS稀释)封闭,室温孵育15min,倾去血清,勿洗。3.每套切片分别滴加1∶100稀释的一抗(Glu、GABA),37℃孵育2h,PBS冲洗3次。4.滴加试剂B(生物素化二抗工作液,即生物素标记的山羊抗兔IgG),37℃孵育15min,PBS冲洗3次。5.滴加试剂C(辣根酶标记链霉卵白素工作液),37℃孵育15min,PBS冲洗3次。6.DAB呈色:取1ml双蒸水,加入DAB试剂盒中的试剂A一滴,混合均匀后将试剂B和试剂C各一滴加入其中,再次混匀(现用现配,避光保存,30min内使用)。将混均的显色液加至切片上,室温显色,显色时间为30min。缓冲液中止显色,蒸馏水充分冲洗。7.苏木素轻度复染。梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。8.阴性对照切片以PBS代替第一抗体进行孵育(步骤3),其他同上述步骤。对照切片未发现阳性产物即无特异性反应。1.2.2.半定量分析方法采用Q550CW型(德国Leica)图像分析系统,参照王平宇《大鼠脑读片提要及图谱》对下丘脑室旁核(PVN)、孤素核(TNS)、疑核(NA)、延髓头端腹外侧核(RVLM)、延髓尾端腹外侧核(CVLM)和胸3节段脊髓灰质中间外侧柱(IML)区的Glu、GABA免疫阳性产物进行半定量分析。每只大鼠的PVN取6张切片,TNS、NA、RVLM、CVLM均取12张切片,IML取18张切片。用低倍镜(4×10)进行定位,并锁定测量框。每个核团以中央为标志(上、下、左、右)取4个视野,每个视野面积为0.05mm2,在40×10倍光镜下测量阳性神经纤维和细胞的积分光密度(IOD值)。1.2.3对氨基神经释放的检测1.2.3.肌肉注射和喷洒法大鼠经3%戊巴比妥钠(20mg/kg)腹腔麻醉,俯卧位固定,湿纱布擦试颈背部皮肤,剪去背毛暴露皮肤。两耳连线剪一横切口(1.5cm左右),在其中点向尾侧沿皮下剪开2cm,将皮分离两侧。紧贴大鼠头骨依次逐层剪开各肌层,并将断端依次拉向尾侧,扩大视野。有出血时,用干纱布按压止血,保持术口清晰。接近颈后黄韧带时,小心地用7号注射针头分离附近的肌肉,暴露寰枕膜。用1ml注射器,针尖端近水平刺入蛛网膜下腔,缓慢抽取脑脊液,一般采集量为100～200μl。取样顺序运动组和对照组交替进行。1.2.3.上清液机理及分析条件1.样品前处理:将样品和5%磺基水杨酸1∶1混合,充分混匀。10000rpm/min,离心10min,析出沉淀物,取上清液上机测试。2.分析条件及分析方法:分析柱2.6mm×150mm不锈钢柱;树脂为日立#2619;柱温53℃;流速0.225ml/min;压力80～130kg/cm2;循环时间70min;茚三酮流速0.3ml/min、压力15～35kg/cm2,分析变换5kg/cm2;标准品浓度5nmol/50μl(购自Sigma公司);氮气压力0.28kg/cm2。1.3主试剂和设备1.3.1博士德生物技术有限公司兔抗鼠Glu、GABA单科隆抗体(浓缩液),购自武汉博士德生物技术有限公司。SP-9001型SABC免疫组化染色试剂盒、浓缩型DAB显色试剂盒、PBS,购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.3.2光学显微镜和图像分析系统冰冻切片机(CM3050S,德国Leica公司);光学显微镜(日本Olympus公司);Q550CW型图像分析系统(德国Leica公司);835型氨基酸自动分析仪(日本日立公司)。1.4学显著性水平检验应用SPSS10.0统计分析软件进行数据处理,统计学显著性水平取P<0.05。以独立样本t检验比较运动组和对照组各项指标的差异。根据列文方差一致性检验结果判断方差是否一致,当方差缺乏一致性时,用校正t检验。2结果2.1神经核团内密度的变化光学显微镜下可见:Glu和GABA免疫阳性物质呈棕黄色或棕红色。Glu和GABA免疫阳性产物在下丘脑室旁核(PVN)、孤束核(NTS)、疑核(NA)、延髓头端腹外侧核(RVLM)、延髓尾端腹外侧核(CVLM)、胸3脊髓灰质中间外侧柱(IML)等各神经核团内的密度在运动组和对照组之间具有明显的差异,主要体现在阳性细胞数量上的不同,肉眼不能区分阳性细胞内阳性产物的灰度差异(图1～图20)。2.2glu/gaba检测运动组大鼠经过8周中等强度游泳训练后,PVN内GABA、NTS内Glu、CVLM内GABA的免疫阳性产物积分光密度以及NA内Glu/GABA比值均明显高于对照组(P<0.05),而PVN内Glu免疫阳性产物积分光密度和Glu/GABA比值明显低于对照组(P<0.05)。2.3氨基酸类递质及氨基酸类递质、gaba+gly实验观察期结束时,运动组大鼠脑脊液中GABA含量明显高于对照组大鼠,差异具有显著性(P<0.05),其他氨基酸类递质以及(GLU+ASP)/(GABA+GLY)在两组间没有显著性差异。3讨论3.1pvn教育对交感兴震性神经元的作用下丘脑室旁核(periventricularnucleus,PVN)是下丘脑前区传入、传出纤维联系最为复杂的核团之一,它不仅具有神经内分泌的功能,而且参与了自主神经系统对机体功能的调节,特别是在维持心血管活动的动态平衡中发挥重要的作用。大量研究证实,PVN具有交感兴奋性功能。电刺激和化学刺激PVN可以增强交感神经活动。PVN注射GABA受体兴奋剂或阻滞剂可以相应地降低或增加交感神经传出冲动、动脉血压和心率,提示,GABA能神经对PVN的交感兴奋性具有紧张性抑制作用。本研究发现,运动组大鼠PVN内的Glu免疫阳性产物含量明显低于对照组,而GABA免疫阳性产物含量明显高于对照组,致使Glu/GABA比值明显低于对照组大鼠(P<0.05)。运动组大鼠PVN内Glu神经结构的降低,以及GABA神经结构增多,可以降低对PVN内交感兴奋性神经元的兴奋作用,同时,加强对PVN内交感兴奋性神经元的紧张性抑制作用。本研究结果结合以往研究成果提示,PVN存在交感兴奋神经元,而正常静息状态下,内源性或外源性的GABA对交感兴奋神经元具有紧张性抑制作用。长期有规律的中、小强度体育锻炼可以增强PVN内的GABA抑制机能,从而减弱安静状态下的交感神经紧张性。3.2精神内源性神经元孤束核(nucleustractussolitarius,NTS)是内脏反射活动的初级整合中枢,接受躯体和大部分内脏器官的感觉传入。NTS上有一系列心血管感受器传入神经纤维的投射(动脉压力和化学感受器传入神经、心迷走机械和化学敏感性传入神经、肺机械敏感性传入神经),这些传入神经在NTS处释放的神经递质主要是谷氨酸。研究证实,NTS内部也存在内源性的GABA能神经元以及GABA受体。本研究发现,运动组大鼠NTS内的Glu免疫阳性产物含量明显高于对照组大鼠(P<0.05),且主要集中在神经胞体内,提示,运动组大鼠NTS内的兴奋性神经元数量增多,这种兴奋性神经元上调具有的生理意义目前还不是十分清楚。但有研究证实,NTS内存在内源性的Glu神经元,并且投射到副交感节前神经元所在核团疑核(NA)和迷走神经背核(DMVN)处。因此,可以推测,长期有规律的体育锻炼可以通过上调NTS的内源性Glu能神经元,经由“NTS-NA(DMVN)”通路,有助于增强副交感神经紧张性。3.3na内心迷走神经元类型分布心血管的副交感神经节前神经元主要发自延髓的疑核(nucleusambiguous,NA)和迷走神经背核(dorsalmotorvagalnucleus,DMVN)。采用荧光逆行神经束路追踪技术,证明分布至心脏的副交感神经纤维起自疑核和迷走神经背核,且以疑核为主。既往研究证实,NA和DMVN存在Glu能神经和GABA能神经,且在调节心血管活动中具有重要的作用。近期的研究进一步表明,NA内的心迷走神经元至少接受3种类型的神经支配:1)Glu能神经:刺激NTS可通过Glu能传导通路,引起NA内的心迷走神经元产生NMDA受体和on-NMDA受体介导的Glu能突触后电流,这条通路在调节压力反射中发挥重要作用。2)GABA能神经:体内和体外实验均表明,NA内的心迷走神经元接受GABA能神经纤维的支配,GABA能神经在心率的反射性和紧张性控制中发挥重要作用,刺激NTS可激活GABA传导通路。3)胆碱能神经:乙酰胆碱可兴奋NA内的心迷走神经元。本研究在NA内可见Glu免疫阳性神经终末、GABA免疫阳性神经胞体和突起,证实NA内具有Glu能神经纤维的投射,以及内源性和外源性GABA能神经,这与前人的研究结果相一致。与对照组大鼠相比,运动组大鼠NA内的Glu/GABA比值明显升高,说明NA内“兴奋-抑制”之间的动态平衡向兴奋一侧转移。由于有研究证实,NA接受来自于NTS内Glu能神经和GABA能神经的支配。本研究的实验也发现,NTS内Glu免疫阳性神经结构在运动组明显升高,因此,可以推测NA内Glu/GABA比值的升高有部分原因是由于NTS向NA投射的Glu能神经增多。鉴于心血管副交感神经的节前神经元位于NA。因此,Glu/GABA比值的变化必然要影响机体对心率和血压的反射性和紧张性调控。3.4glu能神经元/gaba免疫延髓是最基本的心血管中枢,同时,又是基本的呼吸节律中枢。现已知道,延髓腹外侧区有两个重要的心血管中枢分别位于延髓头端腹外侧区(RVLM)和延髓尾端腹外侧区(CVLM)。RVLM是交感心血管活动整合的重要中枢,目前研究认为,RVLM是参与心血管调节的升压区。CVLM这一区域有抑制交感兴奋性的神经结构,目前研究认为CVLM是调节心血管功能的降压区。形态学研究证实,RVLM内存在内源性的Glu能神经元,并且,投射到脊髓中间外侧柱的交感节前神经元。RVLM内还存在外源性的Glu能神经投射及其相应的受体。肖振祥等研究发现,RVLM内Glu能神经传入至少可通过NMDA受体介导交感紧张性兴奋。进一步研究证实,RVLM的兴奋性传入可能来自NTS、PVN等中枢核团的纤维投射。形态学研究也证实,RVLM内存在GABA能神经元和神经终末以及高密度的GABA能受体,其受体存在GABAA和GABAB两种亚型。GABAA受体在调节心血管反射活动中起着重要作用。GABA微量注射到RVLM,可引起血压降低、心率减慢,RVLM神经元紧张性放电抑制,注射其拮抗剂(荷包牡丹碱)可阻断并反转此效应,结果提示,GABA对RVLM交感兴奋性神经元具有紧张性抑制作用,且其作用是由GABAA受体所介导。而RVLM内GABA抑制性神经元主要来源于CVLM,研究证实,CVLM通过短轴突的抑制性神经元的轴突投射到RVLM,其轴突末梢释放抑制性神经递质GABA。本研究在RVLM和CVLM均可见Glu和GABA免疫阳性结构。与对照组大鼠相比,运动组大鼠CVLM内的GABA免疫阳性神经元密度明显增高(P<0.05),增高了13%。由本研究结果可以推测,大鼠8周中等强度的游泳运动可通过上调CVLM向RVLM投射的GABA能神经纤维,从而增强对RVLM内交感节前神经元的抑制作用。3.5glu能神经检测调节心血管反应的交感神经低级中枢位于颈和上胸部(T1～T4或T5)水平的脊髓灰质侧角,密集于侧角内中间外侧核(intermediolateralnucleus,IML)。因此,本研究取T3节段进行观察。脊髓存在外源性的Glu能神经的投射,及其相应受体。神经解剖学以及电生理学研究证实,IML的Glu能神经终末主要来源于RVLM内的前交感神经元。微电泳Glu至脊髓中间外侧柱,可增强交感神经节前神经元放电,并且引起心率和血压升高。本研究发现,IML内Glu免疫阳性神经纤维密度在运动组和对照组之间无明显差异,提示,8周中等强度的游泳运动对大鼠心血管低级调节中枢(脊髓中间外侧柱)内Glu能神经的影响不显著。3.6瞳内神经元的结构脑组织和血液、脑脊液之间具有屏障结构存在,这种屏障结构的作用是保证中枢神经系统的神经细胞周围有一个相对稳定的微环境,使脑和脊髓不致受到内、外环境各种化学和物理因素变化的影响,以保障神经细胞的功能得以正常进行。位于脑和脑脊液之间的屏障结构称为“脑脊液-脑屏障”,一般认为,室管膜上皮是“脑脊液-脑屏障”的结构基础,但室管膜上皮之间实际上是借缝隙连接结合的,间隙宽度为2～3nm,允许大分子通过,故这一屏障并不完整,脑脊液和脑内神经元的细胞外液能相互交通,脑脊液的化学成分与脑组织细胞外液的成分大致相同。因此,测定脑脊液的成分可以反映脑细胞的外环境状况。神经解剖学研究证实,脑内的许多结构存在触液(接触脑脊液)神经元,如PVN、中缝背核、海马等,这些神经元不仅存在于脑室的周围,而且,在远离脑室的部位也存在。因此,脑脊液中化学成分的改变必然会影响到触液神经元的功能。另一方面,研究也发现,有些触液神经元具有旁分泌功能,分泌产物可以影响脑脊液中的化学成分,进而通过脑脊液再影响其他部位的触液神经元的功能。因此,脑脊液和触液神经元之间可以相互影响。刘艺萍等研究证实,下丘脑室旁核内存在与脑脊液接触的神经元和神经突起结构。本研究发现(表3),运