地中海贫血基因检测和结果分析课件

地中海贫血的实验室检测和结果分析精选ppt1地中海贫血的实验室检测和结果分析精选ppt1主要内容一、什么是地中海贫血及分布二、地中海贫血的致病机制三、地中海贫血的基因诊断四、最新的地中海贫血检测方法五、检测结果分析及报告精选ppt2主要内容一、什么是地中海贫血及分布精选ppt2一、什么是地中海贫血定义：由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋白肽链合成减少或缺失，导致血红蛋白的α链/非α链比例失衡，而引起的一组遗传性溶血性疾病，亦称海洋性贫血。

血红蛋白病：由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋白分子的一级结构发生改变，从而导致血红蛋白的分子结构发生改变的一组遗传性疾病。☆地中海贫血是最常见的血红蛋白病，珠蛋白合成障碍性贫血为国内称呼，国外不用。精选ppt3一、什么是地中海贫血定义：由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋地中海贫血分类地中海贫血

地中海贫血

地中海贫血δ

地中海贫血γ

地中海贫血δ

地中海贫血εγδ

地中海贫血血红蛋白变异体溶血性异常血红蛋白（如HbS、C等）地中海贫血样变异（如HbCS、E等）其他异常血红蛋白（如HbM、Coimbra等）精选ppt4地中海贫血分类地中海贫血地中海贫血地中海贫血δ地

地中海贫血分类1、按照一个单倍型上的

-珠蛋白基因的功能缺陷定义

0地贫（也有称地贫1）：

-珠蛋白基因完全基因记为--/丧失功能。

+地贫（也有称地贫2）：-珠蛋白基因保基因记为-/留有部分功能。精选ppt5地中海贫血分类1、按照一个单倍型上的-珠蛋白基因的功能

地中海贫血分类2、按照肽链内切酶分型

缺失型地贫：珠蛋白肽链存在片段缺失而造成功能缺陷非缺失型地贫：珠蛋白肽链上不存在缺失，而是（点突变）由于基因的点突变造成的肽链功能缺陷精选ppt6地中海贫血分类2、

地中海贫血分类3、根据

基因缺失或突变个数可分为：静止型：缺失1个基因，基因型记为-/1个基因突变，基因型记为/T轻型：缺失2个基因，基因型记为：--/或-/-2个基因突变，基因型记为：

T/T

中间型：缺失3个基因，基因型记为：--/-缺失与突变混合，基因型为：--/

T或纯合突变重型：缺失4个基因，基因型记为：--/--缺失与突变混合，基因型为：--/

T

精选ppt7地中海贫血分类3、根据基因缺

地中海贫血分类1、根据肽链的功能缺失

0地贫：珠蛋白基因功能完全丧失，不能合成肽链

＋地贫：珠蛋白基因尚保留部分功能2、根据临床症状静止型地贫：突变杂合子（N/+），中国人少见轻型型地贫：突变杂合子（N/+、0/N）中间型地贫：突变双重杂合子/突变纯合子（+/+、0/+）重型地贫：突变双重杂合子/突变纯合子（0/0、0/+）精选ppt8地中海贫血分类1、根据肽链的功能缺失精选ppt8中国人HPFH和δβ-地贫的基因突变类型及表型特征

突变类型缺失长度(kb，缺失型)

或受累基因(非缺失型)HbF(%)Gγ(%)其它种族缺失型Gγ+(Aγδβ)0-地贫中国型≈1009.3～21.283～100—广州型＞4319.495—云南型～909.3～16.772～90—GγAγ-HPFH东南亚型29.7±0.514.1～27.057～63越南、柬埔寨人Aγ-HPFH-196(C→T)Aγ14.3～20.981～95意大利人GγAγδβ-地贫-29(A→G)β22.340—精选ppt9中国人HPFH和δβ-地贫的基因突变类型及表型特征突变类型世界地中海贫血的流行分布精选ppt10世界地中海贫血的流行分布精选ppt10广西地中海贫血的流行分布853共5789例224例834例790例1033例1349例1559例Baise

Hezhou

Yulin

FangchengguangLiuzhouNanningXiong,etal.ClinGenet2010精选ppt11广西地中海贫血的流行分布853共5789例224例834例7广西地中海贫血的流行分布血红蛋白病分组阳性样本数%α-地中海贫血88615.32静止型携带者3636.27α-地中海贫血特征4988.6HbH病250.43β-地中海贫血3706.39携带者2874.96复合α-地中海贫血791.36中间型地中海贫血40.07δ-地中海贫血90.16携带者60.1复合α-地中海贫血30.05血红蛋白结构变异220.38携带者170.29复合α-地中海贫血40.07复合β-地中海贫血10.02总计128722.25精选ppt12广西地中海贫血的流行分布血红蛋白病分组阳性样本数%α-地引起

珠蛋白表达降低的常见缺失突变类型分布––MC10kb0kb20kb30kb40kb–10kb3’HVRinterξHVR5’3’

2

1

2

1

––THAI––BRIT––FIL––MED––SEA

–

4.2–

3.7–

2.7––SPAN––HW–

27.6–

11.1–

2.4精选ppt13引起珠蛋白表达降低的常见缺失突变类型分布––MC10kbBlackBelgianIndianMalaysian2GermanTurkishItalianGantoneseYunnaneseChineseS.E.AsianTaiwanese

0kb50kb100kb150kb

G

A

LCR引起

地中海贫血常见的基因缺失突变类型分步精选ppt14Black012种见于中国人群的

2/1珠蛋白基因点突变

CD31CD125EXONIEXONIIEXONIIIIVSIIVS

IIUTRUTR5’3’CD13CD59CD122CD142CD44CD49CD30

2

1MissensemutationMinideletionorinsersionTerminationmutationFrameshiftCD78CD74CD118精选ppt1512种见于中国人群的2/1珠蛋白基因点突变CD启动子突变异常剪接起始密码突变移码突变无义突变3’UTR突变EXON1IVS1EXON2EXON3

IVS2显性突变5’3’

46种见于中国南方人群的

-珠蛋白基因点突变

精选ppt16启动子突变EXON1IVS1EXON2EXO中国南方人群最为常见的地贫类型精选ppt17中国南方人群最为常见的地贫类型精选ppt17二、地中海贫血的致病机制

●胎儿血红蛋白主要由两条

珠蛋白链、两条

珠蛋白链组成，还含有

γ链、ɛ链、ζ链组成●成年人的血红蛋白由两条

珠蛋白链和两条

珠蛋白链组成血红蛋白红细胞

链

链血红素铁

链

链精选ppt18二、地中海贫血的致病机制

●胎儿血红蛋白主要由两条珠蛋白链二、地中海贫血的致病机制11p15.3β珠蛋白基因簇16p13.3α珠蛋白基因簇HbA

HS

40ζ

ψζψ

2

ψ

1

2

1θHS54321εGγAγψβδβ精选ppt19二、地中海贫血的致病机制11p15.3β珠蛋白基因簇16p1二、地中海贫血的致病机制人体不同发育时期的珠蛋白生成变化规律精选ppt20二、地中海贫血的致病机制人体不同发育时期的珠蛋白生成变化规律二、地中海贫血的致病机制静态突变点突变片段突变动态突变

碱基替换移码突变串联重复的三核苷酸序列随着世代的传递而拷贝数逐代累加缺失重复重排基因突变的分子机制基因致病突变是地贫发生的分子基础精选ppt21二、地中海贫血的致病机制静态突变点突变片段突变动态突变二、地中海贫血的致病机制精选ppt22二、地中海贫血的致病机制精选ppt22三、地中海贫血基因分析1、Gap-PCR用于α和β等缺失型地贫的检测ψα2ψα1ψξ1

α2α1θ1SEA3.74.2ABCDEFG原理：普通的酶无法扩增出长距离的片段，通过设计出与缺失序列的两侧翼序列互补的引物，当存在缺失时，由于肽链靠近从而扩增出片段。精选ppt23三、地中海贫血基因分析1、Gap-PCR用于α和β等缺失精选ppt24精选ppt24三、地中海贫血基因分析2、PCR-RDB用于检测α和β点突变PCR膜条杂交显色精选ppt25三、地中海贫血基因分析2、PCR-RDB用于检测α和精选ppt26精选ppt26三、地中海贫血基因分析地贫基因检测的策略：α地贫：先检测常见缺失型，然后检测非缺失（点突变），最后是未知的缺失和突变位点。因为>90%α地贫为常见的三种缺失型（--sea,-3.7,-4.2)。β地贫：先检测点突变，然后检测少见的缺失型。大部分β地贫都是点突变型。

精选ppt27三、地中海贫血基因分析地贫基因检测的策略：精选ppt27血红蛋白病的筛查及基因诊断的技术流程精选ppt28血红蛋白病的筛查及基因诊断的技术流程精选ppt28遗传咨询

产前地贫携带者筛查策略同时正常产检对象（孕妇及其配偶）α地贫分子诊断

知情同意选择胎儿产前基因诊断血液五分类分析（关注MCV和MCH）+血红蛋白电泳（HbA2)双方某项指标均同时降低一方正常，另一方的指标降低地贫全套检查异常的一方做地贫全套检查α-地贫特征β-地贫特征ID双方均为α-地贫特征一方为α-地贫特征，另一方为ID或β-地贫特征+-单纯性ID或单纯性β-地贫双方均为β-地贫特征ID或β-地贫特征的一方做α地贫分子诊断

夫妇双方基因诊断血R正常的一方做α地贫分子诊断

-单纯性ID或单纯性β-地贫-++仅异常血红蛋白必要时测序或选择其中一种地贫检测精选ppt29遗传咨询产前地贫携带四、最新的地中海贫血检测方法1、融链曲线分析法用于检测α或β缺失和点突变Thongperm,etal.JournalofMolecularDiagnostics.2010XiongF,etal.JMolDiagn.2011ChristinaV，etal.ClinicalChemistry.2003原理：根据每条肽链都有自己的Tm值，从而可以通过温度差来判断精选ppt30四、最新的地中海贫血检测方法1、融链曲线分析法用于检测四、最新的地中海贫血检测方法2、MLPA（多重连接探针扩增）用于寻找未知缺失断裂点Xiao-FengWei，etal.AnnHematol.2011精选ppt31四、最新的地中海贫血检测方法2、MLPA（多重连接探针扩增）四、最新的地中海贫血检测方法3、毛细管电泳可以检测α非缺失CS（HbCS)和

βE地贫HbAHbEHbA2CanLiao,etal.EuropeanJournalofHaematology.2010精选ppt32四、最新的地中海贫血检测方法3、毛细管电泳可以检测四、最新的地中海贫血检测方法4、DHPLC（变性高效液相色谱）用于缺失型和突变型地贫都可以李倩，南方医科大学论文，2010精选ppt33四、最新的地中海贫血检测方法4、DHPLC（变性高效液相色谱四、最新的地中海贫血检测方法5、基因序列测定（PCR+毛细管电泳）用于未知突变位点或确定缺失片段的位置

由于仪器比较贵重，技术要求高，目前尚未在临床一线推广，只在科研实验室里开展。AzamAmirianMSc，etal.ArchivesofIranianMedicine.2011精选ppt34四、最新的地中海贫血检测方法5、基因序列测定（PCR+毛细管四、最新的地中海贫血检测方法6、母体血浆中胎儿游离核酸的测定严提珍，国际输血及血液学杂志，2009精选ppt35四、最新的地中海贫血检测方法6、母体血浆中胎儿游离核酸的测定严提珍，国际输血及血液学杂志，2009精选ppt36严提珍，国际输血及血液学杂志，2009精选ppt36五、检测结果分析及报告

（一）地贫基因诊断1、--SEA/

2、

/

3、

/

4、--SEA/-

4.25、--SEA/-

4.26、--SEA/-

3.7

7、

/

8、

--SEA/

9、DNAMarkerα缺失型地贫电泳结果123456789精选ppt37五、检测结果分析及报告

（一）地贫基因诊断1、--SEAα非缺失杂交结果CS纯合WS杂合未检测到6种突变（注意不是正常）精选ppt38α非缺失杂交结果CS纯合WS杂合（注意不是正常）精选ppt341-42N654N-28N71-72N17N

EN31N27/28M41-42M654