第十章反刍动物营养实验技术-图文

第十章反刍动物营养实验技术-图文第一节人工瘤胃技术一.人工瘤胃技术概述人工瘤胃技术是体外研究瘤胃微生物营养与代谢的一类技术方法，又称瘤胃模拟培养法。由于人工瘤胃技术不受试验动物的限制，可以在常规实验室条件下进行研究，因此得到了越来越广泛的应用。早期的人工瘤胃技术主要应用于较简单的研究目的。如Woodman和Evan(1938)，通过体外瘤胃发酵证实纤维素在瘤胃内降解的唯一中间产物是葡萄糖，终产物是VFA和乳酸。Quin（1943）用体外法研究了不同碳水化合物瘤胃发酵的产气量。Pearon和Smith（1943）用体外法研究了瘤胃微生物对尿素的利用等。McDougall（1948）关于绵羊唾液矿物质组成的研究在人工瘤胃技术发展史上具有重要意义，之后的各种人工瘤胃系统人工唾液的配制均参照了McDougall的研究结果。早期的人工瘤胃发酵装置比较简单，不少装置仅是在厌氧的条件下对瘤胃液进行简单的培养。由于发酵产物在系统内的不断积累，这类系统不能用于要求长时间发酵的研究工作，通常有效的发酵时间为12～24小时。Louw于1949年设计了一套带有透析系统的人工瘤胃装置，将瘤胃液和底物放入渗析袋或半透膜中，然后悬浮在缓冲液内。该装置在一定程度上将底物和发酵终产物分离开，延长了有效发酵时间。二十世纪五十年代至六十年代，人工瘤胃技术在牧草有机物和纤维素瘤胃降解研究方面得到了大量应用。用人工瘤胃技术研究的内容包括不同牧草以及牧草与纯纤维体外降解速度比较；牧草颗粒大小对体外降解速度的影响；体外评定牧草营养价值；用体外牧草发酵测定结果预测体内发酵等。这一阶段的人工瘤胃装置也趋于复杂，以更加接近瘤胃发酵的真实情况。如Donfer使用的发酵装置由32个发酵瓶组成，每个发酵瓶的容积为90ml，装入的发酵液容量为50ml。每个瓶均有进气口和出气口，以每分钟160个气泡的速度向瓶内通入二氧化碳。二十世纪七十年代，随着反刍动物蛋白质营养研究的深入，人工瘤胃技术开始应用于饲料蛋白质的瘤胃降解率评定。1972年，BenBraver发现体外培养法中的氨浓度与瘤胃内氨浓度有很好的相关，并用短期培养法对饲料蛋白质的瘤胃降解率进行了评定。Monhadeva（1979）、Broderik（1978，1979）用短期培养法评定了饲料蛋白质的瘤胃降解率和微生物蛋白的产量。Road（1983）根据瘤胃产气量与氨利用量之间的关系，用能量、微生物蛋白合成量计算了饲料蛋白质的降解率。我国的吴毓群（1988），任鹏（1989）等分别用短期发酵法和持续发酵法测定了饲料蛋白质与干物质的降解率。二十世纪八十年代后期，人工瘤胃技术的应用范围扩展到研究营养物质对瘤胃微生物合成量的影响及营养物质的匹配关系。这方面的研究因难以控制瘤胃内环境而不能在体内进行，例如进行瘤胃NH3浓度与瘤胃微生物合成量关系的研究由于瘤胃和动物本身对NH3浓度有调节作用，这样就不能根据不同NPN在瘤胃内NH3浓度的差异和消失速度判断NPN的优劣。人工瘤胃技术由于容易实现试验条件的控制而具有体内法不可比拟的优越性。这一时期人工瘤胃装置以可控性持续动态发酵的模拟装置为主，中国农业大学自行研制的RSⅠ—Ⅱ型瘤胃持续动态模拟装置即属此类型。二.短期人工瘤胃发酵装置测定瘤胃产气量短期人工瘤胃发酵装置可以根据研究目的进行不同的设计，其共同特点是静态发酵，不对底物和产物进行分离，因而只能持续较短的时间。但试验装置简单，在饲料营养价值评定等研究方面仍具有很大的价值。下面介绍英国Rowett研究所用于测定瘤胃微生物产气量的人工瘤胃技术，其主要用途是研究不同粗饲料及添加剂等对饲料瘤胃降解及甲烷气能损失的影响。人工唾液的制备：人工唾液由蒸馏水、矿物质元素溶液、微量元素溶液、刃天青（reazurin）溶液混合而成。将混合溶液置于三角瓶中，水浴加热至39℃之后加入还原液。将以上混合溶液置于39℃磁力搅拌器上不断搅拌，同时通入CO2气泡，直至溶液颜色由蓝变至粉红最后变为无色透明，表明人工唾液已呈还原状态。升高CO2通气管至液面以上，并连续通入CO2，调整PH值至7.0～7.30。矿物质溶液:Na2HPO45.7gKH2PO46.2gMgSO40.6g加蒸馏水至1升微量元素溶液:CaCl2·2H2O16.12gMnCl2·4H2O10.0gCoCl2·6H2O1.0gFeCl2·6H2O0.8g加蒸馏水至1升缓冲溶液（PH7.0～7.3）:NaHCO335g（NH4）HCO34g加蒸馏水至1升刃天青溶液:100mg/100ml人工唾液:蒸馏水矿物质溶液缓冲液微量元素溶液刃天青还原溶液蒸馏水1MNaOHNa2S9·H2O(mg)23.81.016847.52.033671.33.050495.04.067250023.75120.0120.00.060.61最终容积（ml）1000475240.0240.00.121.221500712.5360.0360.00.181.832000950.0480.0480.00.242.44瘤胃液制备：抽取瘤胃液（一般从2-3只试验动物抽取并混合，经三层纱布过滤）。将瘤胃滤液加入到人工唾液中，人工唾液与瘤胃滤液的体积比例为2:1。发酵管的制备：发酵管可以选用50～100ml的玻璃注射器，上有刻度。称取200mg待测样品加入每一个发酵管中，并准确记录加入的待测样品重量。抽入30ml瘤胃液，排出空气后用橡皮帽封口。置入39℃水溶摇床上发酵。空白对照管仅加入瘤胃液，不加待测样品，以校正产气管。对于化学物质等对产气量的影响研究还应加入不含化学物质而仅含待测样品和瘤胃液的对照。对粗饲料，读产气量数据的时间为3，6，12，24，48，72小时；对于精饲料，24小时内的读数次数应适当增加。开始发酵的前24小时内应轻轻混匀发酵管内容物2-3次。三.持续动态人工瘤胃发酵系统持续动态人工瘤胃发酵系统的结构较为复杂，可以应用于常规饲料营养价值评定、蛋白质饲料瘤胃保护技术、各种化学试剂和药物对微生物代谢影响及瘤胃营养调控等方面的研究。由于应用持续动态人工瘤胃系统进行的研究通常要求持续发酵的时间为2-10天，因此需要对整个系统的技术条件有一个严格的要求，以接近瘤胃发酵的真实情况。⒈持续动态人工瘤胃发酵系统的技术指标1.1瘤胃液与人工唾液的比例：以1:1较为理想，随着人工唾液比例的增加，发酵液的PH增大，NH3浓度下降。1.2外流速度：早期的持续动态人工瘤胃装置固相和液相的外流速度相同，后来认识到这与瘤胃内容物的排空情况不一致。Hoover等（1991）在总结相关研究工作的基础上提出，持续动态人工瘤胃装置的液相外流速度以0.12%/h、固相外流速度以0.042%/h为好。在实际应用过程中最好根据研究目的，通过试验确定。1.3温度：对系统的发酵温度控制一定要准确，即使0.5℃的差异也会对结果产生明显的影响。由于瘤胃微生物对高温特别敏感，应特别注意发酵温度不超过40℃，即使在40℃下经过较长时间，也可观察到活性下降。适宜的发酵温度为39℃。1.4PH值：用于提取瘤胃微生物的动物，其日粮应根据研究目的而定。如以淀粉的瘤胃降解为研究目的，动物的日粮中应含有较高比例的淀粉。瘤胃微生物可以从瘤胃液制备，也可以从瘤胃内容物制备。从瘤胃液制备时，用硬质塑料管从瘤胃的不同部位吸取瘤胃液，过滤后备用。从瘤胃内容物制备时，取瘤胃内容物置入盛有生理盐水的塑料袋中，用力拍打后过滤，滤液备用。如以获得微生物的最大活力为目的，可将瘤胃液直接加入系统中；如研究目的为测定微生物的养分需要量，则应向系统中加入提取的瘤胃微生物。⒊维持厌氧状态：发酵系统应有良好的气密性，以防止空气进入。发酵开始前向系统中通入CO2和N2的混合气体（CO295%+N25%），以排除原有空气。发酵过程中的厌氧状态可以通过不断通入CO2（40m2/min）来维持，气密性良好的情况下也可靠发酵过程中产生的CO2来维持。⒋搅拌：在持续发酵装置中可以通入的CO2起到搅拌的作用，也可由电机（6-7转/分）或磁力搅拌器进行搅拌。发酵系统的搅拌不易太剧烈，有研究表明剧烈搅拌对纤维素的降解有不利影响。⒌氧化还原电位（Eh）：在厌氧环境中，不断积累的还原性物质使发酵系统的还原性不断增强。在瘤胃内通过产生烷排除多余的电子对，将瘤胃液的Eh维持在-350-500μV之间。对于持续发酵的人工瘤胃系统可以通过加入还原剂调节Eh，常用的还原剂有硫化铜、维生素C及半胱氨酸和胱氨酸等。四.持续动态人工瘤胃发酵系统RSⅠ—ⅡRSⅠ—Ⅱ是中国农业大学动物科技学院冯仰廉主持研制的持续动态系统。该系统吸收了短期发酵装置和尼龙袋为固相的长期发酵装置（Ruitec）的优点，进行试验研究的重复性好，不同试验周期和不同发酵罐间测定结果的变异系数一般小于5%。该系统在模拟瘤胃内环境方面做到了非均一性，即在让饲料与发酵测定混合的同时，可以模拟瘤胃内饲料自然分层的现象。发酵罐的喂料量和喂料次数可