酸奶的制备及革兰氏染色技术

18200要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证明，肠内乳酸菌与安康长寿有着格外亲热的直接关系。中文学名乳酸菌 目： 乳杆菌目Lactobacillales界： 细菌界 乳杆菌科科：厚壁菌门 Lactobacillaceae门：Firmicutes 属： 乳杆菌属Lactobacillus纲： 芽孢杆菌纲Bacilli 代谢类型：乳酸菌是用蛋白液培育成的，在15--23度能快速的成长，并且分解蛋白，更有利于人体吸取凝固型酸乳的加工〔一〕原理利用乳酸菌在适当的条件下发酵产生乳酸，使乳的pH降低，导致乳凝固并形成酸味。〔二〕材料与方法材料颖乳或复原乳，保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌，脱脂乳培育基。仪器设备高压均质机，高压灭菌锅，酸度计，酸性pH试纸，超净工作台，恒温培育箱等。方法121℃，灭菌15min。菌种活化与培育用灭菌后的脱脂乳将粉状菌种溶解，用接种环接种于装有灭菌乳的三角瓶和试管中，42524h〔有助于风味物质的提高，再进展其次次、第三次接代培育，使保加利亚杆菌和嗜热链球菌的滴定酸度分别达110°T90°T以上。1∶1的比例混4%423.5～4.0h。制备成母发酵剂，备用。工艺流程原料乳→加糖→预热→均质→杀菌→冷却→接种→装瓶→培育→冷却→成品。操作要点5%～7%的砂糖。53℃，20～25MPa下均质处理。9015min。424%。比例：杆菌：球菌=1∶1。423～4h。〔三〕质量评定可参照GB2746-1999进展感官指标味和其他外来的不良气味。微生物指标大肠菌群数≤90个/100ml，不得有致病菌。3.理化指标脂肪〔扣除砂糖计算，全乳固体，酸度70～110T，砂糖≥5.0%，汞〔Hg计〕≤0.01×10-6。酸奶是乳酸菌和牛奶发孝的!酸牛奶是酸菌和牛奶发孝以后在加的水!工艺流程原料乳→净乳→标准化→预热(60℃)→均质 (150～250千克/厘米2)→杀菌→冷却→添加发酵剂→分装→发酵→冷藏(0～5℃)→检验→发送制作方法原料要求：用于制作发酵剂和生产酸乳的原料乳必需是高质量的，要求酸度在18°T以下，杂菌数不高于50万个/毫升，总干物质含量不低11%，具有颖牛乳的味道和气味，不得有外来异味，如饲料味、苦味、臭味和涩味等。不得使用乳腺炎乳。热处理：牛奶通过90～95℃5有助于酸乳成品的稳定性，防止乳清析出。接种与发酵：经预处理并冷却至45℃左右的牛乳，泵送至可以保温的缓冲罐中，同时将发酵剂按活力和比例用泵打入发酵罐中，与乳充分混合。将接种后的乳经灌装后放入发酵室，培育温度为42～45℃，时间为2～3小时，进展发酵。在发酵过程中，对每个托盘上的发酵乳要认真观看，必要时要取样检查，当 PH值到达4.5～4.7时，即可终止发酵，并马上冷却。冷却：为了把握产品确实定酸度，发酵终了的冷却格外重要。正常的冷却速度是在发酵终了时，1～1.5小时内将温度降至10～15℃以内。凝固型酸乳在动身酵室时必需留意轻拿轻放不得振动，否则破坏了蛋白质的凝乳构造而乳清析出。质量标准1.感官指标：色泽：色泽均匀全都，呈乳白色或稍带微黄色。味道气味：具有纯乳酸发酵剂制成的酸牛乳特有的味道和气味，无酒精发酵味、霉味和其它不良气味。组织状态：凝块均匀细腻、无气泡、允许少量乳清析出。2.理化指标：脂肪≥3.00%，全乳固体≥11.5%，酸度 70～110°T，砂糖≥5.0%，汞≤0.01%ppm。微生物指标：大肠菌群≤90个/毫升，致病菌不得检出。革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。未经境形成鲜亮比照，可以清楚地观看到细菌的形态、排列及某些构造特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法。方法简介是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，这种染色法是由一位丹麦医生 汉斯·克里斯蒂安·革兰〔HansChristianGram，1853年－1938年〕于1884年所制造，最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷白氏肺炎菌之间的关系。未经染色之细菌，由于其与四周环境折光率差异甚小，故在显微镜下极难观看阳性紫色阴性红色。染色后细菌与环境形成鲜亮比照，可以清楚地观看到细菌的形态、排列及某些构造特征，而用以分类鉴定。原理通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会消灭缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜快速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。常见致病菌金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等 属革兰氏染色阳性菌。百日咳杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等属革兰氏阴性。所以依据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分别鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。试验方法步骤革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：涂片固定。草酸铵结晶紫染1分钟。自来水冲洗。加碘液掩盖涂面染约1分钟。水洗，用吸水纸吸去水分。加95%酒精数滴，并轻轻摇动进展脱色，20秒后水洗，吸去水分。蕃红梁色液〔稀〕染2分钟后，自来水冲洗。枯燥，镜检。原理通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会消灭缝其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜快速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。染色结果革兰氏正反响菌体都呈紫色，负反响菌体都呈红色。临床意义其重要的临床意义在于：1.鉴别细菌2.选择药物3.与致病性有关：：革兰氏阳性菌能产生外毒素，革兰氏阴性菌能产生内毒素，两者的致病作用不同。特性染色后细菌与环境形成鲜亮比照，可以清楚地观看到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法，马上标本固定后，先用龙胆紫染色，加碘液媒染后用酒精脱色，再用蕃红复染。染色后除可以看到细菌形态外，还可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保存紫色者为 革兰氏阳性菌〔G+。被酒精脱色染成红色者为革兰氏阴性菌〔G-。革兰氏染色原理尚不愿定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁构造通透性、等电点等因素有关。致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、碳疽杆菌等属革兰氏染色阳性菌。百日咳杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等均属革兰氏阴性。所以依据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分别鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。鉴定原理革兰氏染色该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁构造和成分的不同所打算的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保存初染时的颜色，呈现蓝紫色。试验流程1、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用 marker 笔画一个小圈〔用来大致确定菌液滴的位置〕。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。2、涂片：液体培育基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰四周 5cm左右翻开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在干净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最终将接种环在火焰上烧灼灭菌。固体培育基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。3、晾干：让涂片在空气中自然枯燥。4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定〔以不烫手为宜〕5、染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染 1min。6、水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简洁染色完毕可观看细胞形态。7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。8、脱色：吸去残留水，连续滴加 95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，马上水洗。9、复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色完毕。可能误差在试验中常常会消灭假阳性和假阴性的结果，假阳性主要是由于脱色不完全，可在试验中常常会消灭假阳性和假阴性的结果，假阳性主要是由于脱色不完全，可能是由于涂片过厚，或者是结晶紫染色过度，导致脱色不完全。假阴性可能是由于细胞固定过度，造成细胞壁通透性的转变，而消灭假阴性结果；另外，细胞培育时间太长，可能已经有局部细胞发生死亡或者自溶，也导致细胞壁通透性的转变而消灭假阴性结果。简介乳酸杆菌是指能使糖类发酵产生乳酸的细菌,酸牛奶中有此菌。原理分别筛选微生物菌种的根本程序乳杆菌属乳酸杆菌科，因发酵糖产生大量乳酸而命名。存在广泛。嗜酸性，最适ph5.5～6.0,ph3.0～4.5仍能生存，在无芽胞杆菌中其耐酸力最强。肠道乳酸杆菌可分解糖产酸，抑制致病菌及腐败菌的生殖， 乳酶生即由活的乳酸杆菌制成，可治疗消化及腹泻。酸牛奶中的乳酸杆菌也有抑制肠道致病菌的作用。龋齿活动状态与唾液乳酸液杆菌计数之间有明确的相互关系。分别筛选微生物菌种的根本程序流程优良糖化酶菌株的分别与筛选溶化培育基→倒平板→打散孢子团粒→梯度稀释→涂布平板→培育观看→滴加碘液→挑菌落→接种→培育→糖化酶活力测定→菌种保存酸乳制品中的乳酸菌的分别制培育基→倒平板→梯度稀释→涂布平板→培育观看→挑菌落→接牛乳管→培育观看→传代培育→选择凝乳管→乳酸测定→菌种保存步骤优良糖化酶菌株的分别与筛选溶化淀粉察氏培育基，稍冷后倒平板与斜面数个。取种曲少许，参与10mL带玻璃球的无菌生理盐水的三角瓶中，用力振荡打散孢子团粒，使之形成均匀的孢子悬浮粒。然后将其用无菌纱布过滤于无菌试管中。1010-730.2mL，于淀粉察氏培育基平板上用无菌涂布器分别依次涂布23个皿，301~2d。〔5〕性能测定：测定各菌落的糖化酶活力。酸乳制品中的乳酸菌的分别制备BCG牛乳养分琼脂培育基。10g50mL1.6%0.07mL，0.075MPa压力下灭菌20min。2g，溶于50mL水中，加酵母膏1g，溶解后调pH6.8，0.1MPa压力下灭20min。③趁热将上述两液以无菌操作混合均匀，倒平板6个，待凝固后，置37℃培育24h，假设无杂菌生长，即可使用。1010-710-7、10-62个稀释度的稀释液各0.1~0.2mL，分别置于上述各养分平板上，用无菌涂布器依次涂布2343℃培育48h，如消灭圆形稍扁平的黄色菌落及其四周培育基亦为黄色者初步定为乳酸菌。将典型菌落转至脱脂乳发酵管，43℃培育8~24h，假设牛乳管凝固，无气泡，呈酸性，镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色呈阳性，则将其连续传代假设干次，43℃培育，选择出3~4h能凝固的乳管，保存备用。乳酸菌的鉴定及生物量的测定。乳酸菌的鉴定方法形态和培育特征观看承受牛肉膏蛋白胨培育基,将已纯化后的甘油菌种活化后于37℃下培育20～24h,并进展革兰氏染色及菌体形态和菌落特征的观看。染色方法参照微生物鉴定试验指导生长条件试验(1)耐盐性试验(NaCl浓度:0.85、1.201.71)(mol/L);(2)耐酸碱试验(pH:4.3、5.7、6.8、8.4、8.68.7);(3)温度梯度试验(温度:10℃、30℃、40℃、50℃、55℃、6065℃)。分别将参试菌接种于以上处理的液体培育基中培育48h,记录生长状况。生理生化试验⑴过氧化氢酶测定将试验菌接种于PGY培育基斜面上,37℃培育20h—24h,取一环接种的培育物,涂于干净的载玻片上,然后在其上滴加3%－—15%的过氧化氢,有气泡则为阳性反响,无气泡为阴性反响。⑵葡萄糖产酸产气试验PY30g5%吐温-80,1.6g/100mL1.4mL作指示剂,在培育基内放置一小倒管,分装试管置3724h,经培育后,指示剂变黄表示产酸,倒管内消灭气泡,表示产气。⑶淀粉水解试验接种颖的菌种于含有0.5g可溶性淀粉的PY根底培育基中,取少许培育液于比色盘内,同时取未接种的培育液作比照,分别在其中参与卢哥氏碘液.不显色表示淀粉水解,显蓝黑色或蓝紫色时,表示淀粉未水解或水解不完全。⑷明胶液化试验将试验菌接种于明胶根底培育基中,置37℃培育,未接种的比照管置于冰箱或冷水中,等待比照管凝固后记录试验结果,反复观看比照屡次。如比照管凝固时,接种管液化为阳性反响,凝固为阴性反响⑸甲基红〔M.R〕试验接种试验细菌于PYG372天后，于培育物中参与几滴甲基红酒精溶液，如呈红色，表示阳性。⑹乙酰甲基甲醇V-P试验接种颖的试验菌种于培育基中,372天后,1mL在其中1ml10％的NaOH3－42%氯化铁溶液。数小时后，培育基外表的下层消灭红色者，为阳性⑺柠檬酸盐取幼龄菌种接种于柠檬酸盐斜面培育基上，适温培育3－7天，培育基呈碱性〔蓝色〕者为阳性反响，不变者则为阴性⑻酪素水解试验牛奶平板的制备：取5g50mL蒸馏水中〔或用50mL脱脂牛奶〕，另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即3－5株菌。适温培育1、3、5天，记录菌落四周和下面酪素是否已被分解而呈透亮。配制该培育基时，切勿将牛奶和琼脂混合灭菌，以防牛奶凝固⑼厌氧生长测定将菌种接入养分肉汤平板后,用密封带包好放入CO2372天后,观看生长状况,生长则为阳性厌氧硝酸盐产气接种封油：以斜面菌种用接种环接种后，用凡士林油〔凡士林和液体石蜡为1:1〕封管，封1厘米。必需同时接种不含有硝酸钾的肉汁胨培育液作比照。2－7d能按可疑或阴性处理。石蕊牛奶的反响其产酸、产碱、胨化、酸凝固、凝乳酶凝固、复原状况糖发酵试验将需要测定的糖或醇类等碳水化合物参与PY根底培育基中,按表分装含5mL培育基的试管.分别取0.2mL,被鉴定菌株接到灭菌后的碳水化合物培育基中37℃培育24h,时取培育液少许置于比色盘内,同时取未加碳水化合物的PY培育液作为比照,滴加试剂比较颜色的变化,记录产酸的强弱.附一些培育基：①PY培育基〔100mL〕：蛋白胨1.0g,酵母提取物1.0g,无机盐溶液4.0mL[盐溶液成分:无水CaCl2 0.2g,MgSO4 20.0g,K2HPO4 1.0g,,KH2PO4 1.0g,NaHCO310.0g,NaCl2.0g](将CaCl2和MgSO4300mL蒸馏水中,500mL蒸馏水,一边搅拌一边缓慢参与其他盐类.连续搅拌直到全部溶解,1000mL,4℃)②PYG培育基:PY1.0g葡萄糖5g3g、明胶120g、蒸馏水1000mL、pH6.8～7.0；加热溶解、校正至pH7.4～7.6，分装小管，12110min，取出后快速冷却，使其凝固。复查pH6.8～7.0④柠檬酸盐斜面培育基：柠檬酸钠3g NH4H2PO41g MgSO4 0.2gK2HPO41g NaCl5g 15—20g1000mLpH71.6%10mL,5mL，12130min2g硝酸钾入养分肉汤4.16SrD