基因表达调控-转录

基因表达调控—基因的转录调控基因表达调控在在基因工程中的意义基因工程的本质即是将外源基因与载体进行体外拼接后转入宿主细胞，使宿主高效稳定地表达蛋白质产物，因此基因表达调控的分子机制是基因工程原理的指导思想。结构基因或者蛋白编码基因的表达都是需要转录和翻译2个环节，而每个环节都存在不同的基因表达调控的位点。基因表达的时空性其实也是通过对转录和翻译两个环节的调控实现的。其中转录调控是更为关键和主要的调控位点。基因表达调控具有时空双重性：时序调控是指基因表达的先后次序和相对强弱；空间调控是指基因表达的区域和环节。基因表达第一步—转录转录是指以DNA的一条链（编码链或反义链）为模板，在RNA聚合酶（以DNA为模板的RNA聚合酶）的作用下，合成RNA的过程；为更清楚地研究转录，我们人为的将转录分为三个阶段：转录起始转录延伸转录终止Figure9.7Transcriptionhasthreestages,whichinvolvedifferenttypesofinteractionbetweenRNApolymeraseandDNA.TheenzymebindstothepromoterandmeltsDNA,remainsstationaryduringinitiation,movesalongthetemplatedurignelongation,anddissociatesattermination.

转录起始RNA聚合酶结合于启动子（Promoter)序列启动子（Promoter)是一段提供RNA聚合酶定位与结合的靶序列。一般来说，启动子位于基因上游，一般不超过200bp。一旦RNA聚合酶定位并结合于启动子，即可启动转录过程，因此启动子是基因表达调控的重要顺式元件。启动子具有以下几方面的特性：序列特异性：在组成启动子的DNA序列中，一般由20bp是相对保守的，其中更换或增减一个核苷酸就可能导致转录速度发生变化；方向特异性：为一种极性顺式调控元件，即正反两种方向只有一种有功能；位置特异性：启动子一般只能在受调控基因的上游或基因内部前端。甚至在基因上游，启动子和转录起点之间的距离也是相对固定的；种属特异性：原核生物的不同物种、真核生物不同组织、细胞都可能存在不同的启动子。启动子确定的方法：footprinting原核生物转录起始原核生物启动子：主要以典型大肠杆菌启动子进行分析发现，典型细菌的启动子主要由以下四部分组成：转录起始位点（Inr)：多数细菌的Inr为C（A/G）90T，其中中间一个核苷酸为转录的起始位点；Pribnow盒（-10区）：距离Inr上游6bp处，存在一个6核苷酸的保守序列。因为其中间的碱基的位置在Inr上游的10bp，因此也称为-10区。保守序列：T80A95T45A60A50T96；Pribnow盒中间碱基的位置在-9至-18范围内变动；Pribnow盒的作用是RNA聚合酶的结合位点，RNA聚合酶结合后，使该AT丰富区消耗较少的能量就解开螺旋，此时RNA聚合酶与启动子的复合物便由关闭状态转向开放状态，启动转录。Sextman盒:细菌启动子在距离Inr上游约35bp处,还有另一个6bp的保守序列,即-35区。保守序列：T82T84G78A65G54A45，其中前3个碱基TTG高度保守。Sextman盒是RNA聚合酶的识别位点，RNA聚合酶的一个亚基首先定位于该序列，然后其它亚基与-10区结合；间隔区：90%的大肠杆菌启动子在Pribnow盒和Sextman盒之间有一个16-19bp的间隔区，而间隔区〈15bp或〉20bp的启动子只占少数。尽管此间隔区的序列并不重要，但其长度非常重要，因为它要保证2个盒位于双螺旋的同一侧，才能促进它们与RNA聚合酶的各亚基相互作用。原核生物转录起始原核生物转录起始人们对启动子区的序列进行大量突变的结果表明：对于大肠杆菌或者其亲缘关系密切的其它原核细菌而言，最佳的启动子构成为Pribnowbox位于Inr上游-7bp,Sextman位于Pribnowbox上游17bp处Inr7bpPribnowbox17bpSextmanbox原核生物转录起始原核细菌的RNA聚合酶（RNApolymerase)：以DNA为模板的RNA聚合酶。原核细菌种仅由一种聚合酶完成全部RNA的转录；大肠杆菌RNA聚合酶的结构：RNA聚合酶全酶由5个亚基构成，分别为

2

，

，总分子量为480KDa。事实上，RNA聚合酶在转录前和转录过程中均以核心酶（2

，）和

因子两种分离形式存在于细胞内，并且实验证明RNA聚合酶识别序列的特异性取决于

因子。RNA聚合酶中各亚基的功能：识别启动子RNA合成；抑制剂：利福霉素，利迪链霉素’负责与DNA结合增强聚合酶与启动子的专一性结合原核生物转录起始EubacterialRNApolymeraseshavefourtypesofsubunit;a,b,andbhaveratherconstantsizesindifferentbacterialspecies,butsvariesmorewidely.原核生物转录起始在转录以前，核心酶与DNA之间就有亲和力，这种亲和力来自蛋白碱性侧链基团和DNA磷酸根骨架之间的静电引力，无序列特异性，为二者之间的松弛结合。当亚基与松弛结合在DNA任何位点的核心酶结合后，核心酶构象发生了改变：全酶与非特异DNA序列的亲和力下降几万倍，致使全酶从非特异的DNA链上脱落下来，而后亚基与-35相互作用，使聚合酶识别特定的启动子序列，形成封闭的启动子复合物。RNA聚合酶结合到覆盖-35区到-10区上下游在内的约60bp。然后在－１０区内的碱基对打开，产生开放复合物（因为－１０区为ＡＴ富集序列，ＡＴ之间只有２个氢键，因此消耗较低的能量即可打开双螺旋）。形成开放的启动子复合物后，转录就开始了，这时亚基又从全酶与ＤＮＡ和ＲＮＡ的复合物中解离下来，全酶变成核心酶后继续延伸转录。（MarrMTetal,1997,Science,276:1258-1260)

RNApolymerasepassesthroughseveralstepspriortoelongation.Aclosedbinarycomplexisconvertedtoanopenformandthenintoaternarycomplex.原核生物转录起始调控组成性调控（constitutivecontrol):依赖于多种类型的启动子结构控制所属基因的时空表达,这种作用基本上依赖于因子对启动子多样性结构的识别与选择;调节型调控(regulatorycontrol):依赖启动子上游的操纵子结构与其相对应的调控因子的相互作用。原核生物转录起始调控启动子结构决定转录起始的基础水平大肠杆菌以及其它的原核生物启动子的共有序列是可变的，在-35box和－10box都允许在一定范围内变化。这些变异体与Inr附近及转录单位前50个核苷酸左右的特征不十分明确的序列共同影响启动子效率,即每秒内启动的有效起始数目。有效起始可以使RNA聚合酶移出启动子并开始合成全长转录物。启动子序列影响有效起始过程的具体方式不清楚。但目前认为：-35box的精确序列影响与亚基的识别，从而影响RNA聚合酶结合速度；从封闭的启动子复合物到开放的启动子复合物的转化依赖-10box的序列；起始失败的频率由+1以及临近下游的核苷酸决定。当然以上结论都还只是一个合理的“假说”，因为的确发现不同的启动子之间的起始效率可以差1000倍，即强启动子（strongpromoter)指导有效起始比弱启动子强1000倍．我们称之为基础转录速度（basalrateoftranscription)不同.原核生物转录起始调控大肠杆菌或其它原核生物具有结构不同的启动子，这也就需要RNA聚合酶依赖一系列不同的转录调控因子来识别这些不同的启动子，起始转录。但是通过改变核心酶的结构来迎合启动子多样性是不现实的。因为这种改变同时会抑制RNA聚合酶识别其它启动子，导致该酶的广泛适应性下降；而且RNA聚合酶对DNA序列识别特异性主要取决于亚基。因此亚基多样性的存在是对应于启动子的多样性的，至少是RNA聚合酶应付启动子多样性的一种方法。因此亚基对基因表达调控的作用就可以表现在：当一种亚基取代另一种亚基，即可以关闭一组基因，同时打开另一组基因，因此也有理由认为亚基是原核生物基因表达的开关。而且对亚基结构的研究发现：亚基由2个主要组分构成：核心酶结合区；-35/-10box结合区。其中核心酶结合区在不同亚基中有很高的同源性，而后者在序列上存在较大的差异。原核生物转录起始调控E.colisigmafactorsrecognizepromoterswithdifferentconsensussequences.(Numbersinthenameofafactorindicateitsmass.)

原核生物转录起始调控转录起始的调节型调控：操纵子模型（与原核基因组结构有关的一种调控）原核生物在基因组结构方面与真核生物的不同之处其中之一：原核生物基因组中功能相关基因成簇排列，并共享用一套启动子等调控元件；而真核生物的每个基因均有自己的调控系统，并且基因在DNA上的排列是离散的，无功能上的明显相关性。原核生物这种生物功能相关的结构基因成簇排列所组成的转录单位称为操纵子（Operon)。操纵子功能相关的结构基因的表达产物协同完成一个生理过程，这些结构基因在一套调控系统作用下统一开放、关闭，维持精细的基因产物分子比，这对于原核生物而言是最经济有效的基因表达调控模式了。原核生物转录起始调控原核生物转录起始调控操纵子的组成：结构基因（G）：3-8个生物功能相关的结构基因以相同的极性密集排列；启动子（P）：一般来说，一个操纵子只含有一个启动子，少数则具有几个启动子;终止子（T）：每个操纵子具有一个或者多个能使转录不同程度终止；在多重终止子的情况下，它们或位于整个操纵子的末端，或分散于一些结构基因的下游，使结构基因转录产物根据需要灵活变化；操纵子（O）：由一个或者多个顺式调控元件组成，其功能是与基因表达的反式作用因子结合，这种蛋白质-DNA二元复合物通过与启动子-RNA聚合酶复合物的相互作用，对操纵子的开放或关闭进行调控。操纵子结构操纵子操纵子的控制网络模式：正控制系统：指当调节蛋白因子与操纵子结合后，其结果如果是操纵子开启，则为正控制系统；负控制系统：指当调节蛋白因子与操纵子结合后，其结果如果是操纵子关闭，则为负调控系统；激活蛋白：正控制系统中的调节蛋白因子阻遏蛋白：负控制系统中的调节蛋白因子诱导状态：加入小分子物质（诱导物）使操纵子中的结构基因表达增加。包括诱导正控制系统和诱导负控制系统。阻遏状态：加入小分子物质（共阻遏物）使操纵子中结构基因表达减少。包括阻遏正控制系统和阻遏负控制系统。操纵子的控制网络模式乳糖操纵子是最早发现的，也是最经典的操纵子模型。乳糖操纵子中的结构基因主要是编码细菌中与糖代谢有关的酶。乳糖操纵子的结构：包括启动子、操纵子、终止子以及编码调节蛋白因子（阻遏蛋白lacI)的调节基因和３个参与糖代谢有关的酶的结构基因乳糖操纵子全长6+kb，左端为编码调控蛋白因子的基因lacI及自身独立的启动子和终止子；lacI下游是Plac,启动子和操纵子部分重叠,操纵子下游延伸到第一个结构基因lacZ区之中有26bp;lacZ之后为另2个结构基因lacY、lacA。lacZ编码

-半乳糖苷酶：以半乳糖苷类化合物（乳糖、IPTG）为底物，催化生成单糖；

lacY编码具有半乳糖苷渗透酶活性的膜蛋白，功能是将胞外的半乳糖苷转运至胞内；

lacA编码半乳糖苷乙酰化转移酶，可以将乙酰辅酶A中的乙酰基转移到半乳糖苷或者其它类似物上，但具体生理功能不清楚。

乳糖操纵子Operoncomposition

Thethreestructuralgenes，Plac控制

Z,-galactosidase,

Y,galactosidepermease(atransportprotein),

A,thiogalactosidetransacetylase(anenzyme,unknownfunction)

Aregulatorrygene:lacI,codingarepressor.乳糖操纵子乳糖操纵子属于负控制系统，也就是说调控蛋白lacI的存在并结合，使操纵子处于关闭状态。lacI关闭操纵子的机制是阻止RNA聚合酶启动转录，而不是抑制RNA聚合酶与启动子的结合。当细菌生长环境中出现半乳糖苷类化合物时（诱导物），它与lacI阻遏蛋白特异性结合，阻止了lacI阻遏蛋白对操纵子的负控制作用。即在无诱导物时，由于阻遏蛋白lacI呈活化状态结合于操纵子上，因此操纵子不能转录；当诱导物出现时，诱导物依赖于高亲和性与操纵子竞争阻遏蛋白，使阻遏蛋白由活化状态变为失活状态，并离开操纵子区，使操纵子开放。但是从以上过程我们可以看到，阻遏蛋白合成与诱导物的存在是没有关系的，因此阻遏蛋白是在和操纵子结合的状态下才与诱导物遭遇的。换句话说，乳糖操纵子是在关闭状态下为诱导物诱导开放的，而不是诱导物阻止了阻遏蛋白与操纵子的结合。那么操纵子在无诱导物存在的情况下，是为阻遏蛋白所关闭的，但是这种关闭状态并非完全关闭，只是以一种基础水平表达这三种糖代谢有关的酶类。Repressormaintainsthelacoperonintheinactiveconditionbybindingtotheoperator;additionofinducerreleasestherepressor,andtherebyallowsRNApolymerasetoinitiatetranscription.乳糖操纵子阻遏蛋白与操纵子的相互作用：

Olac的DNA序列的结构特征：26bp区域横跨Inr-5到+21，以+11为对称轴，两边各有6bp的典型对称序列（TGTGTG和AATTGT），其中靠近对称轴的两对对称序列在与lacI蛋白的结合中其重要作用，这种对称结构与lacI的四聚体对称性是对应的。结合定点突变实验发现，+5-+17的13bp区域对突变更敏感，而该区域并不对称，现证明对称序列只是识别为点，而真正的结合为点是偏向对称轴左侧的不完全对称区域。阻遏蛋白lacI具有与小分子诱导物和操纵子序列结合的双重能力，必然存在2种不同类型的结合结构域：lacI经过胰蛋白酶处理发现，N端1-51位氨基酸有与操纵子结合的能力，只是结合程度有所减弱；而C端60-360位氨基酸具有形成四聚体的能力以及与诱导物结合的活性。色氨酸操纵子色氨酸操纵子的结构：5个参与色氨酸生物合成的结构基因：trpE,trpD,trpC,trpB,trpA启动子P下游为操纵子序列Otrp在Otrp与第一个结构基因trpE之间有一段162bp的前导序列trpA下游300bp区域内有两种性质不同的终止子（+，+，）与Otrp作用的阻遏蛋白的编码基因位于启动子之前较远的区域中在细菌体内不缺乏色氨酸的条件下，色氨酸作为共阻遏物激活阻遏蛋白TrpR，使TrpR以活化形式结合于Otrp，从而关闭操纵子；当细胞内色氨酸浓度降至临界点时，TrpR释放Trp转变成失活状态，并从Otrp移到其他低亲和力区，操纵子开放。色氨酸供应短缺时，基因活化，色氨酸过剩时，与阻遏因子结合，抑制基因转录转录延伸由于细菌只有一种RNA聚合酶，因此这种RNA聚合酶完成所有RNA的转录；转录起始结束后，

亚基释放出来，因此完成转录延伸的是核心酶；其催化的化学反应是将核糖核苷酸去除、-磷酸基团加到转录产物的3，末端，形成3-5磷酸二酯键。在转录延伸阶段，细菌RNA聚合酶沿模板移动，形成一个非碱基配对的长约15-20bp的转录泡(transcriptionbubble)。在这个转录泡中，延伸的转录物通过长约8核苷酸的RNA-DNA碱基对结合到模板链，进行链的延伸。而RNA聚合酶覆盖的DNA片段长约30bp，延伸复合物的稳定主要依靠酶的、，亚单位。这两个亚单位与转录泡之前的一段短双链DNA接触，DNA-RNA杂交体位于此复合体内，转录物RNA即由此复合体产生。(NudlerEetal,1996,Science,273:211-217;NudlerEetal,1998,Science,281:424-428)转录延伸转录终止转录启动以后，RNA聚合酶沿DNA模板链移动，持续合成RNA链，直至遇到终止信号，RNA聚合酶停止聚合反应，并从DNA模板上释放出来，而此时DNA-RNA之间的氢键也被破坏，使转录产物释放出来。人们通过比较原核生物转录出来的RNA，发现终止信号存在于转录出来的序列中，这种为转录提供终止信号的RNA序列称为终止子结构，相应的DNA编码序列称为终止子。大肠杆菌终止子分为：本征终止子（intrinsicterminator)：除RNA聚合酶核心酶以外，不需要其它的蛋白辅助因子便可借助特殊RNA结构实现终止；

因子依赖型终止子：终止作用依赖于专一蛋白辅助因子（

因子）转录终止本征终止子结构特征：发夹结构：形成发夹结构的为RNA区域内的一段回文序列，长7-20bp，2个反向重复序列及中间不配对的序列形成发夹的茎环结构。茎的长度可变，通常G、C丰富。RNA结构中的发夹结构均可以导致RAN聚合酶延缓或者暂时停止，不同的终止子结构造成的延缓时间长短差异很大。一般来讲，茎中的GC含量越高，延缓时间越长。但是发夹结构本身并不足以终止转录反应，只是为终止提供了一个有利条件；6个U组成的尾部结构：紧邻发夹结构有U构成的尾部结构才是真正的终止信号。处于暂停状态的RNA聚合酶一旦遇到终止信号，便可以从DNA模板上解离下来，因为DNA-RNA杂交双链中，U-A配对的氢键少，因此打破这种双链结构耗能也少。转录终止Intrinsicterminatorsincludepalindromicregionsthatformhairpinsvaryinginlengthfrom7-20bp.Thestem-loopstructureincludesaG-C-richregionandisfollowedbyarunofUresidues.

转录终止

因子依赖型终止子结构的概况：有的模板进行体外转录，并不发生有效的终止反应。RNA聚合酶只是在终止子结构处暂停，但并不能最后终止转录。这时如果加入专一性辅助因子

，就会终止反应，所产生的RNA3，末端序列也为统一的。突变实验表明，终止子上游序列突变会使RNA聚合酶转录过头。因此

因子识别终止位点上游50-90bp区域。其机构特征为：