A特殊毒性实验

第七章特殊毒理学第一节化学毒物的致突变作用2教学内容基本概念和突变类型致突变的机理突变的后果致突变性评价方法3教学目的了解遗传学基础，致突变实验中存在问题；熟悉DNA损伤的修复，机体对致突变作用影响；掌握致突变类型、机制和后果，常用致突变实验的原理教学重点及难点致突变作用的概念致突变作用的类型致突变作用的机制致突变作用的后果Ames试验4§1概述（基本概念）1、DNA56782、基因93、染色质和染色体1011124、细胞周期与细胞分裂细胞从DNA复制起，经过分裂直到把DNA均等地分配到两个新的子细胞的全过程。13细胞周期G1期S期G2期M期1415165、体细胞与生殖细胞体细胞多是二倍体损伤不会遗传给子代生殖细胞单倍体突变可传给子代176、遗传与变异18

自发变异DNA的复制错误自发的化学变化诱发变异射线化学诱变剂197、致突变作用外源化学物及其它环境因素能引起细胞核中的遗传物质发生变化，这种改变随同细胞分裂过程而传递的过程称为致突变作用20§2致突变作用的类型21突变基因突变(点突变)染色体畸变染色体数目异常碱基置换移码突变大段损伤倒位易位缺失重复转换颠换插入丢失22碱基置换2324移码25大段损伤大片段损伤是指DNA链大段缺失或插入。这种损伤有时可跨越两个或数个基因，但所缺失的片段仍远小于光镜下所能观察到的染色体变化，故又可称为小缺失。26倒位（逆位）：染色体在某一片段的位置颠倒了180°27易位（转座）：染色体的某一片段移接到另一非同源染色体上28缺失：染色体中某一片段的缺失29重复：染色体中增加了某一片段

30卵圆眼

超棒眼棒状眼X染色体某一区段的重复，会导致果蝇由正常的卵圆眼变为棒状眼的变异，或眼睛更窄小的“超棒眼”。31染色体数目异常32§3致突变的机理一、DNA的损伤以DNA为靶的直接诱变

不以DNA为靶的间接诱变

二、DNA损伤的修复光复活切除修复重组修复SOS修复33（一）以DNA为靶的直接诱变（1）烷化剂的影响烷化剂所致的碱基损伤可表现为错配。烷化剂提供烷基与DNA共价化合；烷化碱基引起DNA二级结构改变。34（一）以DNA为靶的直接诱变（2）平面大分子嵌入DNA链有些大分子能以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间，称为嵌入剂(intercalatingagent)。它们多数是多环的平面结构，易于嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间，造成移码突变。

35（一）以DNA为靶的直接诱变（3）碱基类似物的（baseanalogue）取代取代后的碱基类似物出现异构互变,发生错误配对而造成碱基置换。例如：5-溴脱氧尿嘧啶（5-BU）取代T，2-氨基嘌呤（2-AP）取代G。3637胸腺嘧啶38（一）以DNA为靶的直接诱变（4）改变或破坏碱基化学结构有些化学物可对碱基产生氧化作用，从而破坏碱基的结构，有时还可引起链断裂。还有些物质可在体内形成有机氧化物或自由基，可间接使嘌呤的化学结构破坏，容易出现DNA链断裂。39次黄嘌呤4041（一）以DNA为靶的直接诱变（5）二聚体的形成42（一）以DNA为靶的直接诱变（6）DNA加合物和交联分子的形成亲电子剂极易与蛋白质或核酸等大分子物质中亲核基团（如—SH、—OH、—N=等）发生共价结合，形成加合物或交联分子。如苯并芘代谢产物与DNA形成的加合物分子巨大，使DNA构象改变，诱发突变。亚硝酸、丝裂霉素C等使形成DNA—DNA交联使复制时不能解链，DNA复制和转录完全停止，细胞死亡。烷化剂、苯并芘、砷化物、醛类化合物、一些重金属等与DNA的核蛋白交联形成DNA—蛋白质交联物对DNA构象与功能造成严重影响。DNA加合物的形成可活化癌基因，影响调节基因和抑癌基因的表达。43（二）不以DNA为靶的间接诱变主要涉及细胞分裂过程的改变如纺锤体、微管蛋白的合成与聚合，微管结合蛋白的合成与功能发挥，细胞分裂纺锤纤维的功能发挥等。441、纺锤体抑制（1）与微管蛋白二聚体结合（2）与微管上的巯基结合（3）破坏已组装的微管（4）妨碍中心粒移动（5）其它452、对DNA合成和修复有关的酶系统作用对DNA合成和复制有关的酶系统作用也可间接影响遗传物质。例如，一些氨基酸类似物可使与DNA合成有关的酶系统遭受破坏而诱发突变；铍和锰除可直接作用于DNA外，还可与酶促防错修复系统相作用而诱发突变。修复过程中的酶46复制47切除修复48§4突变的后果

体细胞突变仅影响接触致突变物的个体，不影响下一代。肿瘤、畸形、动脉粥样硬化、糖尿病及衰老等。

生殖细胞突变可影响下一代，甚至人类的基因。基因突变对人类的影响程度分为五类。49对机体无影响，如同义突变；导致对健康无影响的正常人体生化组成的遗传学变异；导致遗传易感性的改变；导致遗传性疾病；致死性突变，造成配子死亡、死胎及自发流产等。先天性疾病都是遗传性疾病吗？50§5化学毒物致突变作用的研究方法51基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性，是评价化学毒物致突变性唯一可靠的方法。还有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件。因此将试验观察到的现象所反映的各种事件称为遗传学终点。遗传学终点分为：基因突变、染色体畸变、DNA损伤等其他遗传损伤的检测52一、主要致突变实验基因突变微生物哺乳动物细胞果蝇哺乳动物植物分析53染色体畸变哺乳动物细胞果蝇哺乳动物真菌植物541、细菌回复突变试验美国加州大学的Ames教授在1979年建立并完善，又称Ames试验（鼠伤寒沙门菌/组氨酸回复突变试验）。55（1）什么是细菌回复突变试验？以营养缺陷型的突变体菌株为指示生物检测基因突变的体外试验。常用的菌株有组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和色氨酸营养缺陷型的大肠杆菌。56（2）鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验原理鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+)组氨酸营养缺陷型突变株(his-)受试物±代谢活化系统利用若干不同基因型组氨酸缺陷型菌株，每个菌株具有其独特的回复突变“靶点”顺序，可以由不同类型的碱基置换和移码诱变剂诱发回复突变。该菌株在无外源性组氨酸供给的情况下不能生长繁殖，但当发生回复突变时则可在无外源性组氨酸供给的情况下生长繁殖，计数诱发的恢复菌落数即可判断化学毒物的致突变性。57代谢活化系统一般是S9混合液。S9即将一组雄性大鼠进行腹腔注射芳香族化合物如多氯联苯油溶液等诱导大鼠肝脏酶系的活性，4d后杀鼠取肝脏，匀浆，经9000g离心得到的上清液。再加入一些辅助因子，如辅酶Ⅱ(NADP)、葡萄糖-6-磷酸，K+／Mg++及缓冲液等组成S9混合液(S9mix)，构成NADPH再生系统。58（3）Ames法原理的依据化学物质引起的诱变往往不是直接的，它要经过生物的消化、吸收，特别是高等生物肝脏中的有关酶的作用后再起作用，也许它本来是可以起到诱变作用的，但经肝脏中酶作用后失去了诱变能力，也许正好相反，相来它不具有诱变的能力，但经肝脏酶作用后，反而获得了诱变的能力，因此经过肝脏中酶的作用才能较真实地反映在动物活体中某种化学物的实际诱变能力。诱变剂仅改变突变的频率，但不改变突变的方向，那么同样诱变剂也能导致回复突变，如果用正突变的话是多方向的，所以必需采用反方向的选择方向才行，而用回突变只需用基本的培养基进行筛选即可，步骤就要简单的多。59（4）测试菌株TA98、TA97（检测移码突变）、TA100（检测碱基置换突变）及TA102（对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感）等。测试菌株含有组氨酸基因突变（hisˉ），脂多糖屏障丢失（rfa），紫外线切除修复系统缺失，抗药性标记R。60（5）Ames检测方法61优点:方法灵敏，检出率高，经试验有90％的化学致癌物经都可获得阳性结果；加之方法比较简便、易行，不需特殊器材，容易推广。缺点:微生物的DNA修复系统比哺乳动物简单，基因不如哺乳动物多，不能完全代表哺乳动物的实际情况。尽管如此，由于存在着上述的优势，故目前在致突变试验中占重要位置，为首选的试验方法。（6）Ames试验的优缺点622、哺乳动物细胞基因突变试验体外培养细胞的基因正向突变试验。原理是在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使细胞暴露于受试物一定时间，然后将细胞再传代培养，突变细胞在含有6—硫代鸟嘌呤或三氟胸苷的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。基于突变集落数，计算突变频率以评价受试物的致突变性。突变频率是指观察到的突变细胞数与存活细胞数的比值。633、果蝇伴性隐性致死试验原理：根据隐性基因在伴性遗传中的交叉遗传特征，即雄性的X染色体传给F1代雌蝇。又通过F1代传给F2代雄蝇。X染色体的隐性突变基因在F1代为杂合体，不能表达，而在F2代雄蝇为半合体，能表达出来，如果雄蝇接触受试物后X染色体出现隐性致死性突变，结果其F2代雄蝇数目较雌蝇少一半。由此推断致死突变的存在。644、转基因动物致突变试验转基因动物指基因组中整合有用实验方法导入的DNA(可以是完整的基因，也可是不完整的DNA片段)，并能遗传给后代的一类动物。目前，用于致突变作用研究的转基因动物主要有商品化的BigBlue小鼠和MutaMouse小鼠。转基因动物致突变试验时，染毒后先抽提纯化不同器官或组织的基因组DNA，把纯化的基因组DNA与噬菌体体外包装抽提物混合，而将导入的基因载体包装进噬菌体中，用这些噬菌体感染大肠菌，可形成噬菌斑，通过噬菌斑颜色变化进行突变的判断并获得突变子。655、染色体畸变分析试验体外染色体畸变分析试验(invitro)常用的分析细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、中国仓鼠肺(CHL、V79)细胞及外周血淋巴细胞等。体内染色体畸变分析试验主要有啮齿类动物睾丸细胞染色体畸变和骨髓细胞染色体畸变试验。染色体结构异常主要可观察到裂隙、断裂、断片、缺失、微小体、着丝点环、无着丝点环及各种辐射体等。染色体数目异常包括多倍体及非整倍体。66676、微核试验(micronucleusassay)微核试验是通过观察有微核的细胞率(‰)，用于检测DNA断裂剂及非整倍体诱发剂。用于微核检测的细胞很多，现已建立了植物细胞(如蚕豆根尖等)、哺乳类动物细胞(如骨髓细胞、肝细胞、肺细胞、淋巴细胞、红细胞、精子等)、非哺乳类动物细胞(如鱼红细胞、蟾蜍红细胞等)的微核试验方法。687、程序外DNA合成试验当DNA受损后，DNA的修复合成可发生在正常复制合成期(S期)以外的其他时期，称为程序外DNA合成。用同步培养将细胞阻断于Gl期，并将正常的DNA半保留复制阻断，然后用受试物处理细胞，并在加有3H-胸腺嘧啶核苷的培养液中进行培养。如果受试物引起DNA损伤，并启动DNA损伤修复机制，培养液中的3H-胸腺嘧啶核苷就会掺人到DNA链中。利用放射自显影法或液闪计数法测定掺入DNA的放射活性，检测DNA修复合成，从而间接反映DNA的损伤程度。许多哺乳动物及人类细胞可用于UDS的检测。748、姐妹染色单体交换试验在DNA合成期，所有染色体均进行复制，复制后形成两条姐妹染色单体。姐妹染色单体交换(sisterchromatidexchange，SCE)可能与DNA的断裂和重接有关，故可间接反映DNA损伤。SCE的观察方法是采用姐妹染色单体的差别染色,在细胞培养液中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)，5-BrdU是嘧啶类似物，在DNA合成期可与胸苷竞争掺人DNA中。DNA复制是半保留复制，经过一次有丝分裂后，5-BrdU掺入后，对染料的亲合力下降，染色后会出现一深一浅两条姐妹染色单体。如果有交换发生就可在光镜下计数SCE。7576二、应注意的一些问题1、体外试验的活化系统无细胞系统哺乳动物细胞宿主介导试验772、阳性对照和阴性对照的设立阴性对照目的是获得实验的基础数据阳性对照目的是证明实验方法的可靠；实验者在本实验条件下完成技术和鉴定致突变物的能力；证实经一段时间后，本实验的重复性。783、致突变实验结果判定首先应检查试验的质量控制情况：试验程序、操作的正确性、pH、渗透压、代谢活化系统的浓度等；盲法观察；资料的统计学分析；试验结果重复性等。阳性结果应当具有剂量—反应关系，即剂量越高，致突变效果越明显，并在观察值与阴性之间有显著差异。79阴性结果判定：最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量；各剂量的组间距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的化学物。对化学物是否具有遗传性或致突变性，通常在检出任一遗传学终点的生物学试验中呈现阳性反应的物质，即可确定其具有致突变性。而要确定某化学物为非致突变物，则需检测5种遗传学终点的一系列试验中，经充分的试验均为阳性。80一、化学致癌物分类根据化学物质致癌作用强度分根据化学致癌物质化学性质和作用机制分按照不同化合物在致癌过程中所表现的作用分按照致癌作用机制分第二节化学致癌物

根据化学物质致癌作用强度分四类（IARC）：I组：确证的人类致癌物

II组：动物致癌物

III组：可疑致癌物

IV组：非致癌物根据化学致癌物质化学性质和作用机制分：1、烷化剂类：直接：芥子气、甲醛、氯甲醚等间接：氯乙烯、苯、丁二烯等2、多环芳烃类：BP、3-MC、煤焦油、二苯蒽等3、芳香胺类：联苯胺、乙萘胺、硝基联苯等4、金属和类金属：砷、镍、铬、铍、镉、硒等5、霉菌和植物毒素类：AFB、微囊藻毒素6、亚硝胺及亚硝酰胺类：7、石棉及SiO28、嗜好品：卷烟、烟草、槟榔、酒类9、药物：包括某些激素、己烯雌酚10、其他：某些植物成分，如蕨菜中的未详物质按照不同化合物在致癌过程中所表现的作用来分:

1、引发物或启动物（initiator）：能启动正常细胞转变为肿瘤细胞的化合物。2、促癌物（promotor）：能导致启动细胞或细胞群增殖的化学物。如巴豆油、佛波纯酯3、催展物（progressor）：能引起启动细胞或在促癌过程中的细胞转变为潜在演进细胞的化合物。有些化学物只有单一作用，而有些则几种作用兼而有之。如砷化合物。

按照致癌作用机制来分1、遗传毒性致癌物：以DNA为靶。直接致癌物、前致癌物、无机致癌物2、非遗传毒性致癌物：作用于DNA以外的大分子如:纺锤丝系统、DNA甲基化酶。一些促癌剂、细胞毒物、激素、免疫抑制剂、固态物、过氧化物酶体等二、致癌物的代谢活化与灭活体内致癌物靶部位活性致癌物致癌性下降、极性高的产物体外靶分子代谢灭活代谢灭活代谢活化致癌有效剂量B(a)P的代谢途径化学致癌物的代谢特点:1、代谢以氧化过程为主,终致癌物有亲电子性；2、代谢活化可在多种组织、器官中进行，虽有器官特异性，但以肝脏为主；3、在种属、品系、家族和个体上的差异与遗传因素决定的代谢酶的多态性有关。三、化学致癌物作用的靶子诱导生成DNA加合物前癌基因（C-myc,N-myc,L-myc,C-raf,B–raf等）抑癌基因(P53)作用于染色体纺锤丝系统作用于与DNA修复或基因表达调控有关的酶系统1、DNA靶子：2、非DNA靶子：第二节化学致癌过程一、化学致癌过程1、是一个多因素、多基因参与的多阶段过程2、细胞增殖（CP）与致癌作用3、细胞程序性死亡与致癌过程4、DNA修复与致癌过程5、某些非遗传机制与致癌过程1、致癌过程有多个与癌肿有关的基因参与前癌基因（ras家族）肿瘤抑制基因(Rb-1;p53)

与程序性死亡有关的基因(bcl-2;myc)

肿瘤易感基因(BRCA1;BRCA2)2、不同器官来源、不同组织类型、临床阶段以至同一种肿瘤在不同地区所见的遗传变化是不同的K-ras突变---胰腺癌、结肠癌50%食道癌和15%乳腺癌---HST1、INT2基因扩增肝癌P53突变类型不同---AFB1高度污染区

K-ras活化---日本胆管癌常见，泰国不见3、多种环境致癌物、致癌因子或条件可协同作用环境中化学物质复杂多样机体内外致癌因素同时作用促癌剂普遍存在参与致癌物代谢的酶系的遗传多态性多个因素的相互作用、相互制约4、个体的不同遗传背景对肿瘤的发生发展有重要影响细胞增殖(CP)在致癌过程的作用至少有四个方面:1、减少DNA修复可利用的时间,增加启动细胞出现机会;2、将修复的损伤通过CP扩展成不可修复的突变；3、致癌过程所必需的不同水平，不同形式的遗传机构损伤必须通过CP才能实现；4、启动细胞要克隆扩增必须通过CP。细胞死亡方式有两种：1、细胞坏死（necrosis）2、程序性细胞死亡（programmedcelldeath,PCD）或细胞凋亡（apoptosis,APO）凋亡基因1、死亡基因（自杀基因，suicidalgene）增殖抑制基因：P53;RB;WT-1

凋亡促进基因：Bax;ICE;C-rel2、抑制细胞凋亡的基因（apoptosis-suppressinggene）

增殖促进基因：c-myc;c-abl;ras;src

凋亡抑制基因：bcl-2;EIB;C-kit;Bel-x遗传毒物终致突变物+DNA加合物DNA损伤细胞死亡静止状态的细胞DNA复制损伤正在复制的DNA加合物的碱基错配复制后修复易错修复修复解毒细胞存活无错细胞存活

突变免疫抑制剂石棉激素苯巴比妥促癌剂直接刺激细胞分裂改变或抑制某些与增殖和分化有关的基因和细胞事件间接刺激细胞增殖细胞恶变癌变某些非遗传机制与致癌过程致癌作用多阶段的模式图“启动细胞（initiatedcell)”:在化学致癌的启动阶段，致癌物直接作用于正常靶细胞DNA的初级序列，引起基因突变，使单个细胞或少量细胞发生永久性的、不可逆性的遗传性改变，此种细胞称之为“启动细胞”第三节化学毒物致癌性的判别化学毒物致癌性的判别1、短期试验2、动物诱癌试验3、人群流行病学观察IARC短期试验系统（1986）第一类：DNA损伤试验，包括与DNA共价结合、诱致DNA短裂或修复、诱导细菌的噬菌体等。第二类：基因突变试验，测量表型和/或遗传型的可遗传改变。第三类：染色体效应试验，包括检出染色体数目和结构改变、SCE、微核、和显性致死突变。（一）哺乳动物长期致癌试验物种选择：大鼠-肝癌、小鼠-肺肿瘤、仓鼠/地鼠-膀胱癌动物数量：一般每组最少50只剂量设计：高、中、低（相当或低于人类实际可能接触的剂量）染毒时间：长期或终生。小鼠：1.5-2年；大鼠：2-2.5年（二）哺乳动物短期致癌试验1、小鼠肺肿瘤诱发试验2、雌性SD大鼠乳腺癌诱发试验3、大鼠肝转变灶试验4、小鼠皮肤肿瘤诱发试验动物肿瘤诱发试验描述性研究临床观察分析性流行病学调查研究可疑人类致癌物人类致癌物人群肿瘤流行病学调查程序人类致癌物的最终判定依据1、流行病学调查结果能够重复；2、有明确的剂量-反应关系；3、有动物致癌试验阳性结果支持。肿瘤是可以预防的

要降低肿瘤的发生率，首先必须识别、鉴定化学致癌因素和有害的生活方式，阐明其作用机理，然后采取措施加以防治。一、控制致癌物的接触二、高危人群的检出与保护三、化学预防

阻止接触，降低吸收量阻止体内生成致癌物细胞外灭活阻断致癌物对靶分子的作用调节基因表达与DNA的修复功能第三节化学毒物的生殖毒性第一节雄性生殖毒性第二节雌性生殖毒性第三节致畸试验第四节繁殖试验第一节雄性生殖毒性一、精子子的生成过程精原细胞→初级精母细胞→次级精母细胞→精子细胞→精子二、毒物对雄性生殖影响

1、对睾丸生精细胞的影响；

2、对内分泌功能的影响；

3、对性功能和生殖功能的影响。

三、雄性生殖毒性的检测方法

1、精子生成分析

①精子计数；②精子形态观测；③精子状态分析试验2、精子穿透试验判断精子的受精能力。3、睾丸中标酶活性的测定主要检测乳酸脱氢酶X（LDH-X)、山梨醇脱氢酶、6－磷酸葡萄糖脱氢酶的变化，并结合精子生成过程中各阶段细胞的功能和形态学改变，来探明其毒性作用的部位和机理。4、体外试验主要将与生殖相关的细胞在体外条件下进行培养，并与受试外源化学物接触，观测其与生殖相关细胞的变化。5、雄性激素检测主要检测卵泡激素（FSH）、黄体激素（LH）和雄性激素。6、显性致死试验接受受试化学物的雄性毒物与未经受试物处理的雌性动物交配，观测雌性动物早期胚胎死亡情况，以评价受试动物是否对雄性动物的生殖有损害作用。7、雄性生殖细胞遗传毒性检测判断生殖细胞DNA是否受毒物损伤的一个评价指标。常用的方法为单细胞凝胶电泳试验，电泳结果呈彗星状，说明DNA受损，电泳结果呈条状。8、雄性生殖毒性病理检测第二节雌性生殖毒性一、雌性生殖细胞的生成过程初级卵母细胞→次级卵母细胞→卵子二、外源化学物的雌性生殖毒性表现

1、对卵细胞的影响2、对内分泌功能的影响3、其它毒性作用如对