高效石油降解菌的筛选及降解效果研究

高效石油降解菌的筛选及降解效果研究

1石油污染治理方法随着经济的快速发展，石油逐渐成为中国的主要能源，其需求日益增加。据调查，石油生产和运输的联系严重污染了土壤，污染范围正在不断扩大。目前，中国石油行业每年产生的含油量为80.14万吨（刘伟等，2007）。由于其高粘度和高粘度，石油在短时间内形成了少量的高污染。长期的石油污染还会影响土壤的渗透性，降低土壤肥力，阻碍植物生长（毛立华等，2006）。此外，各种多环芳烃都具有“三致”作用。一些蒸发成分可能导致人体麻醉、窒息和化学肺炎等疾病（李宝明等，2007）。因此，石油污染对生态系统的平衡和人类健康有重大影响。目前,针对石油污染治理的方法主要包括:物理方法、化学方法以及生物修复方法,但物理方法修复费用较高,耗材较多;化学方法会使用大量化学淋洗剂,很容易造成二次污染.相较而言,微生物修复技术由于生产费用低、不产生二次污染等特点而被视为一项最具应用前景的修复技术(何良菊等,1999).而且随着分子生物学的发展,无论是cDNA文库的建立,还是多态性分析方法的进步,都为污染物的生物修复提供了全新的技术支持.虽然国内外已针对石油污染土壤的微生物修复进行了较多的研究,但很少有研究人员能够筛选出高效的石油降解菌.因此,本文试图从污染比较严重的油田土壤中筛选出高效的石油降解菌,并在了解其降解能力基础上,鉴定其所属菌种,以期能够找到新的高效石油降解菌,丰富基因文库,为我国石油污染治理工作提供支持.2材料和方法杏仁2.1污染土壤的取样考虑到气候对土壤理化性质的影响,以及原油组分等因素对石油降解菌种类的影响,分别在山东胜利油田、新疆克拉玛依油田和陕西长庆油田3个污染比较严重的油田周围进行污染土壤的采样.取样时,去除表土,取2～10cm处污染土壤,每份样品取0.5kg左右.2.2馏水调ph液体培养基使用常见的MSM无机盐培养基,pH=7.5;固体培养基在液体MSM无机盐培养基的基础上加质量分数1.5%的琼脂.淀粉水解酶鉴定培养基:蛋白胨1g、NaCl0.5g、牛肉膏0.5g、可溶性淀粉0.2g、琼脂1.8g、蒸馏水100mL,调节pH为7.2左右;甲基红(M.R.)和萘酚(V.P.)试验用培养基:葡萄糖0.5g、蛋白胨0.5g、K2HPO40.5g、蒸馏水100mL,调节pH为7.2～7.4.柠檬酸盐鉴定培养基:柠檬酸钠0.2g、K2HPO40.05g、NH4NO30.2g、琼脂1.8g、蒸馏水100mL、体积分数0.04%苯酚红1mL,调节pH为6.8～7.0.吲哚反应鉴定培养基:蛋白胨1g、NaCl0.5g,蒸馏水100mL,调节pH为7.6.苯丙氨酸脱氢酶鉴定培养基:酵母浸膏0.3g、Na2HPO40.1g、DL-苯丙氨酸0.2g、NaCl0.5g、琼脂1.8g、蒸馏水100mL,调节pH为7.0左右,以上培养基均参考文献(钱存柔等,2000).2.3测试方法2.3.1基于平板上直线通过富集、分离、纯化进行菌种筛选(梁生康等,2004).取5.0g石油污染土样,接入装有100mLMSM培养液的250mL三角瓶中,在摇床中培养4d(30℃\,150r·min-1);然后取10mL上层清液接入装有100mL新鲜培养液的250mL三角瓶中,再在摇床中培养7d(30℃\,150r·min-1),如此3次.用接种环沾取富集培养液于平板上划线;经过多次划线纯化后,将纯化菌株于LB平板培养后保存于冰箱,用于以后的降解试验以及鉴定试验.2.3.2柴油作唯一碳源和能源菌种在50mL三角瓶中加入20mLMSM培养液、0.2mL灭菌柴油及1mL培养过夜的新鲜菌液(菌数约为109cell·L-1),30℃、150r·min-1条件下在摇床中培养10d,每组做5个平行样,空白试验不加菌,每2d测定1次柴油含量,初始溶液柴油浓度为105.92mg·L-1;用柴油代替原油进行石油降解菌研究,柴油组分以烃类链烃为主,碳数在C9～C26之间,涵盖了石油组分中的大多数链烃类.因此,能够以柴油为唯一碳源和能源的菌种基本上对石油也同样能够利用.本研究中所用的MSM无机盐培养基不含有任何有机成分,此时,柴油起到唯一碳源和能源的作用.取自陕西长庆油田的污染土壤灭菌过筛后混匀,秤取2kg放入瓷盆中,加入一定量麸皮(与土壤质量比1∶7～1∶9)混匀,将活化的石油降解菌100mL接入污染土壤中,空白试验组不添加石油降解菌,保持土壤含水量在40%左右,隔2d翻耕土壤1次,室温(25℃)下进行修复(钟毅等,2006;张旭等,2000;黄延林等,2007),一共进行50d,取样5次.土壤中石油烃初始含量为110.02mg·kg-1,通过比较实验组与对照组半衰期的不同来考察微生物降解污染物的能力.2.3.3石油降解菌16srrna的pcr检测将得到的单菌落接种到LB培养基平板上,30℃培养直到长出菌落,观察菌落形态.利用常规方法(王平宇等,2001)进行革兰氏染色观察;根据常用的细菌鉴定方法(中国科学院微生物研究所细菌分类组,1978)对所筛选细菌进行生理生化试验;采用TIANGEN公司生产的细菌快速提取DNA试剂盒进行石油降解菌总DNA提取;采用一种较普遍的细菌、古生菌的通用引物27F及1492R进行石油降解菌16SrRNA的PCR扩增;PCR反应循环温度设定:94℃预变性5min,94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1min,30个循环,最后72℃继续延伸5min,4℃保存.序列分析方法:PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测纯度以后,送到天根生化公司进行双向测序,引物采用27F和1492R.将双向测序的结果导入GenBank数据库中,通过BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)进行同源性比较.将序列与Genbank数据库中一些相近的相关菌株的16SrRNA序列编辑后再导入到MEGA4.0软件,进行系统发育树的构建,采用相邻连接法(Neighbor-Joiningmethod,NJ)及最大复合似然法(MaximumCompositeLikelihood,MCL)来构建发育树,并估算进化距离.采用自引导法(Bootstrap)1000次重复取样来评估进化树.2.4土壤微生物对柴油的降解采用非分散红外石油仪进行石油烃含量测定(GB/T16488-1996).柴油含量测定:测定时,将三角瓶中液体全部倒入玻璃离心管中,10000r·min-1离心10min,倒出上清液转入125mL分液漏斗中;加3滴体积比1∶1的盐酸酸化,加3.5gNaCl为破乳剂,用5mL精制CCl4溶液清洗原三角瓶,倒入分液漏斗,同时加入10mLCCl4,萃取5min;下层CCl4相经装有无水Na2SO4脱水柱除水后,归入25mL比色管中,萃取两次后定容至25mL,取0.5mL重新定容于25mL比色管中.用1cm石英比色皿在红外分光光度仪下进行测定,与标准曲线对比得到结果.土壤石油烃含量测定:测定时取土样2.5g,放入碾钵中,滴加3滴1∶1(体积比)盐酸,加入2.0g无水Na2SO4研磨均匀后,倒入50mL玻璃离心管中;用移液管取25mL精制CCl4至离心管,拧盖后,放入超声清洗机中进行超声萃取,萃取时间为40min;完毕后,6000r·min-1离心,取上层澄清液0.5mL于25mL比色管中,定容后测定.柴油日平均降解速率计算公式如下:γ=(Wa-Wb)/(ta-tb)(1)式中,γ为日平均降解速率(mg·L-1·d-1),Wa为第a天溶液柴油含量(mg·L-1),Wb为第b天溶液柴油含量(mg·L-1).根据美国环境保护局以及其他研究者的报告(Prince,1993;Jonge,1997;张旭,2000),土壤微生物对石油类污染物的降解遵循一级反应关系,即:dC/dt=-KTC(2)式中,C为土壤中油含量(mg·g-1);KT为基质去除常数(d-1).由式(2)可得:C/C0=exp(-KTt)(3)将式(3)两边取对数后可得式(4).lnC=lnC0-KTt(4)以时间t为横坐标,lnC为纵坐标,对实验点做线性回归,则直线的截距为lnC0,斜率为KT.从而导出土壤中石油烃的半衰期(t1/2)公式(5).t1/2=ln2/KT(5)3结果结果3.1发酵柴油发酵菌株的筛选从山东、新疆、陕西3个不同的油田石油污染土壤中共得到30多株样品,经过多次富集培养以及分离纯化等步骤,得到10多株单菌株.在此基础上,采用降解柴油实验,复筛出3株对柴油具有较高降解能力的菌株,分别命名为WTS、Z3-P\,H4-1.表1中列出了这3株嗜油菌在柴油培养基中的生长状况以及菌落生长特征.3.2株高效菌的降解率和降解速率图1是菌液中柴油降解率的变化情况.由图1可知,在3株嗜油菌的作用下,培养液中柴油含量逐渐降低,而且加入3株嗜油菌的柴油降解变化趋势基本一致,降解率随时间的延长逐渐增加.加入嗜油菌的培养液与不加入嗜油菌的培养液相对比发现,空白溶液中柴油含量大于加入嗜油菌培养液的柴油含量,表明3株嗜油菌都有较高的石油降解能力.培养10d后3株高效菌的降解率均达到60%以上,WTS甚至达到了75%的降解率,远高于空白的降解率(37%),表明在降解过程中,发挥主导作用的是高效嗜油菌.与国内外同类研究相比,3株菌的降解效果处于相对较高的水平,高于石油降解菌B01(林凤翱等,1997)对胜利油田石油类的降解率(25.8%～32.8%),与SY23、SY43、SY21(徐金兰等,2007)等降解菌对石油类的降解率相当(43.8%～58.9%,7d).不同微生物对石油烃可能有着不同的降解能力,在降解过程中起着不同的作用.对3株高效嗜油菌的降解速率进行计算,结果见图2.由图2可知,WTS、Z3-P和H4-13株菌的降解速率均在第2d达到最大.3株菌的最大降解速率均高于同类研究报道的0.01～0.1mg·L-1·d-1(Truaxxddetal.,1995;Atlasetal.,1996;Calabreseetal.,1991),表明这3株菌都能迅速地降解石油烃.3.3织物上含油量随时间的变化污染物降解半衰期是指污染物在污染环境中其浓度降低一半所需要的时间,在生物强化降解过程中,污染物降解半衰期表明了生物对该污染物的降解能力.加入菌剂的样品以及不做任何处理的空白对照样品土壤中含油量随时间变化见图3.由图3中的线性拟合结果可得到基质去除常数分别为0.005、0.023、0.021和0.020,由公式(2)～(5)计算得到实验组和对照组污染油泥的降解半衰期.其中,空白对照组土壤中石油的降解半衰期是139d,投加WTS、H4-1和Z3-P土壤样品中石油的降解半衰期分别是30、33和35d.投加菌剂的土壤中石油的半衰期为自然土壤中石油的降解半衰期的1/4左右.本次研究所得到的降解半衰期要比张旭等(2000)利用综合技术实验得到的石油降解半衰期少11d,更远远短于钟毅等(2006)试验所得的降解半衰期.3.4嗜油菌的筛选和系统发育树的构建对所筛选的3株嗜油菌进行生理生化试验,结果见表2.由表2可知,WTS和H4-1为革兰氏阴性菌,而Z3-P是革兰氏阳性菌,氧化酶试验均呈阳性.这可能是由于革兰氏阴性菌细胞外层是脂多糖,而脂多糖是由脂类和多糖组成的复合物,可以为细胞提供一个既亲水又亲油的两亲分子层;这一方面使其细胞与油滴表面接触,使石油烃易于进入细胞,另一方面能降低水-油界面张力,使柴油变为由细小油滴构成的乳剂,并扩散进入细胞,加速油的降解(Primeetal.,1993).同类研究中革兰氏阳性菌出现的比较少,本研究中革兰氏阳性菌相对也要比革兰氏阴性菌少,但Z3-P表现出的高效降解性却不容忽视.PCR实验结束以后,进行琼脂糖凝胶电泳来检测PCR产物的纯度(图4).图4结果显示,3株嗜油菌PCR产物长度均达到约1500bp,长度足够,且没有杂质条带出现,适合进行序列测定.将PCR产物送到天根生化公司进行测序,并经过拼接,得到WTS、H4-1、Z3-P的16SrRNA的序列,其长度分别是1425bp、1424bp和1430bp,达到分析要求.在NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)上进行同源性比较,结果显示,数据库中均没有与之完全相匹配的细菌菌属,证明这3株菌在以前没有被发现,属首次筛选得到.选取序列相近的菌株,将其16SrRNA序列导入Bioedit