聚乙二醇修饰技术的研究进展

聚乙二醇修饰技术的研究进展

阿卜克斯沃尔科夫等人首次将甲基聚乙二醇（pmg）的共价连接到蛋白质中，以获得比未合成原型药物的pmg-蛋白质化合物更好的疗效。peg装饰技术（即peg装饰）逐渐受到重视，成为药物化学修养的研究热点。PEG在修饰小分子药物时,可以将它的许多优良性质随之赋予所形成的复合物,如提高被修饰药物的水溶性、增加生物相容性、改善组织分布、降低毒性作用、延长循环半衰期和增强疗效等,这使得许多疗效显著但由于其疏水性和毒性大等缺陷而限制临床应用的小分子药物有了新的发展前景,本文将对PEG修饰小分子药物的药物种类、连接臂类型、PEG载体以及修饰后药物药动学性质和药效学性质改变等方面的研究进展进行概述。PEG与药物的连接方式有永久性键合和非永久性键合。永久性键合是指PEG和药物之间通过化学键永久键合,药物发挥药效无需也不能使键合断裂。非永久性键合即为前药的组成方式,是指PEG通过化学键与药物分子“不稳定结合”,在发挥药效时需要在一定的pH值或某些特定的酶的存在条件下,水解释放出原游离药物后发挥疗效。目前研究的PEG负载小分子药物的连接方式大多采用非永久性键合,即通过前药的方式负载小分子药物。前药的组成主要包括小分子药物、连接臂和载体三部分。1peg表面活性剂的组成1.1期短、生物组织分布小分子药物尤其是抗肿瘤药物普遍存在水溶性差、半衰期短、生物组织分布靶向性差和毒性大等缺陷,极大地限制了其临床应用。而PEG修饰药物可以明显改善药物分子的水溶性、体内药动学参数以及减弱其毒副作用等。1.1.1peg修饰技术PEG本身水溶性极好,在很多制剂中作为助溶剂使用,因此,利用PEG作为载体修饰药物对于改善药物水溶性具有重大意义。6-巯嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)在临床上常做抗癌及免疫抑制剂使用,但是其水溶性极差,口服生物利用度低,仅10%～50%进入机体循环系统;其血浆半衰期也很短(0.5～1.5h),清除速率快。Zacchigna等运用PEG修饰技术合成了PEG-6-MP前药,经过修饰后的PEG-6-MP在室温条件下溶解度达到10g·L-1(相当于6-MP1.34g·L-1),极大地提高了6-MP的水中溶解度;此外,3例健康志愿者体内药动学研究表明,PEG-6-MP组的曲线下面积(AUC)值为6-MP组的1.5倍;上述结果表明,经过PEG修饰后,不但解决了6-MP的水溶性问题,而且提高了生物利用度。除此之外,利用PEG修饰技术制备的姜黄素(curcumin,Cur)前药mPEG-丁二酸-脯氨酸-Cur中Cur的溶解度达3.02g·L-1,比Cur原药(27mg·L-1)提高了100多倍。而喜树碱(camptothecin,CPT)经PEG修饰之后在水中的溶解度由原来的2.5mg·L-1提高到了2g·L-1,紫杉醇(paclitaxel)经PEG修饰后水溶性也达到5g·L-1,灯盏乙素(scutellarin)经PEG修饰之后其溶解度约为800g·L-1,比灯盏乙素53.4mg·L-1的溶解度提高了120多倍。由此可见,大多数的小分子药物经PEG修饰后的水溶性均能得到较好改善。1.1.2peg修饰的药动学小分子药物与PEG的连接方式使药物能够缓慢释放或者需在一定的pH或酶存在的条件下才能释放,具有很好的缓释控释作用,因此改善了许多药物的半衰期,延长了药物的作用时间。Zhang等将止痛解痉药物美他沙酮(metaxalone,Met)通过氯乙酰氯与不同分子量的PEG连接制备了PEG-Met前药,并对其体外水解特性进行了考察。几种前药均可以在不同pH的环境下保持相对稳定,并按一定速率释放出原药,例如相对分子质量4000的PEG-Met在60℃的缓冲液中15h释放Met87.3%。由此可以得出,Met经过PEG修饰后药动学参数显著改善,有望使其半衰期延长。酮洛芬(ketoprofen)具有明显的抗炎和解热镇痛的作用,但是口服给药后吸收很快,在1～2h内便达到最高血药浓度,而其半衰期则只有2h,因此临床上需要通过频繁给药来维持有效的药物浓度;而药物作用不持久是抗炎止痛药物最大缺陷之一。Choi等制备了PEG相对分子质量为7500的PEG-酮洛芬的缀合物,其中PEG(7500)-酮洛芬经静脉注射和肌肉注射32h后的血药浓度-时间曲线表明,PEG(7500)-酮洛芬的Tmax大于酮洛芬,而AUC是酮洛芬的1.5倍。体内镇痛实验结果显示,虽然PEG(7500)-酮洛芬的起效时间比酮洛芬晚,但其作用时间却比酮洛芬长,酮洛芬10和40mg·kg-1的作用时间分别是6～7h和8h,相同酮洛芬含量的PEG(7500)-酮洛芬的作用时间却分别能达到24h和48h;抗炎实验也证实了以上结果。由此可以得出,PEG(7500)-酮洛芬在保证药物疗效的同时延长了其作用时间,为减少给药次数和保障用药安全提供了可能。除此之外,经PEG修饰后的多柔比星(doxorubicin,Dox)半衰期由5.68min延长到50.21min;PEG修饰的阿糖胞苷(cytarabine)不仅改善了其半衰期短的缺点,而且可以控制连接方式使其半衰期达到最佳的抗癌半衰期2～6h。综上所述,PEG可以显著改善药物体内代谢特征,使其半衰期及作用时间大大延长。1.1.3主动靶向制剂近年来,靶向药物的研究越来越多,经PEG修饰的缀合物由于其自身特征或在PEG缀合物中加入的适当靶向片段使药物在体内具有靶向性,从而提高药效,减少对机体其他健康组织的损伤。PEG修饰中常见的靶向方式有2种:被动靶向和主动靶向。增强渗透和滞留(enhancedpermeabilityandrentention,EPR),即被动靶向效应,由于肿瘤组织等部位特殊的病理特征,经过PEG修饰之后形成大分子复合物可以选择性地EPR,从而起到被动靶向的作用。Conover等以相对分子质量为40000的PEG为载体,甘氨酸为连接臂,与CPT第20位羟基通过酯化反应合成了PEG-β-CPT,在体内的组织分布实验中发现,PEG-β-CPT组给药2h后,肿瘤组织中CPT的含量显著高于其他组织,明显表现为被动靶向的作用。然而,被动靶向仅存在于大分子量(>30000)的PEG载药系统以及存在类似固体瘤微血管环境中,对于那些能够扩散、迁移以及不能形成固体瘤的癌症及其他疾病,依靠固体瘤病理特征而起作用的被动靶向则难以表现靶向性,此外被动靶向的靶向性不高也是一个重要的缺陷。主动靶向的原理主要是基于受体与配体之间的高亲和性。在现有的几种主动靶向制剂中,最有效且最普遍的是根据癌细胞表面特有的或过量表达的受体,将其配体分子连接到药物-载体缀合物中,使药物进入机体后配体即与受体结合,从而将药物带入靶定部位,常用的靶向片段归纳见表1。在大多数肿瘤组织细胞中,比如卵巢癌、子宫内膜癌、结肠癌、胸腺癌、肺癌以及肾癌等癌细胞中叶酸受体均过量表达,根据这一特点,PEG药物运输系统中加入了叶酸使被修饰的抗癌剂具有靶向性。为了明确叶酸受体的靶向作用,Kim等将叶酸连接到PEG上并用锝(99Tc)和异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记,通过体内和体外实验证明了PEG-叶酸缀合物与细胞上的叶酸受体之间存在的靶向性。Pasut等利用不同分子量的线性和支状PEG作为药物载体,制备了连有叶酸和未连叶酸的吉西他滨(gemcitabine)缀合物,在体外抗增殖活性实验中,叶酸的缀合物对于叶酸受体过量表达的KB-3-1细胞株的亲和力比未连接叶酸的缀合物增加了2～3倍。说明连有叶酸的缀合物比未连接叶酸的缀合物或者游离的吉西他滨对于KB-3-1细胞株具有更强的选择性,这表明叶酸在药物靶向作用中起了重要作用。Chandna等运用促黄体素释放因子(luteinizinghormone-releasinghormone,LHRH)作为靶向片段来制备靶向性CPT。LHRH受体在癌细胞中往往过量表达,利用LHRH多肽作配体可以向癌细胞的LHRH受体提供配位基,从而使药物靶向地集中在癌细胞部位。通过拥有纳米分辨率的原子力显微镜观察经近红外荧光青色素染料(Cy5.5)染色的PEG缀合物,连有LHRH片段的缀合物荧光主要集中在肿瘤处,而未连接LHRH的缀合物荧光则分布较均匀。通过放射性标记缀合物,体内皮下植入人卵巢癌细胞的小鼠模型研究结果发现,未接LHRH的PEG缀合物组织分布比较分散,在肿瘤组织中占40%左右(可能由于EPR效应),而接入LHRH片段的PEG缀合物在肿瘤组织中的分布超过75%,这表明LHRH片段的载入使缀合物有明显靶向作用。由此可见,靶向片段的加入可以使得药物更集中于病变部位,改善组织分布,减少毒性作用,增强药物疗效。1.2peg的药物治疗小分子药物很少可以直接与PEG相连,而各式各样的连接臂可起到桥梁作用,使PEG与多种药物分子相连,而且适当的选择连接臂的种类还可以达到缓慢释放、靶向以及增大载药量等目的。连接臂按照药物释放的机制可以分为以下几种。1.2.1对细胞的药效pH敏感型的连接臂使缀合物在一定的pH下才能够水解释放,保证了其在到达特定环境前的稳定性。前药缀合物多是经过细胞内吞作用进入细胞,然后与溶酶体或内涵体融合,此时的酸性环境往往有利于pH敏感型连接臂的水解释放出药物分子;病变部位如肿瘤组织的pH(5～6),比正常组织的略低。上述人体的生理或病理特征为开发酸敏感型连接臂提供了有利条件。PEG或mPEG负载Dox的连接方式采用了酸敏感型的酯和席夫碱来控制前药在细胞内的释放,两种缀合物在体外模拟溶酶体的酸性环境下能够稳定的释放,在pH7.4的生理盐水中释放缓慢;而对细胞的杀伤力并没有因释放减慢而减弱,其中通过席夫碱连接的缀合物对于P388细胞株表现出了明显的杀伤作用,其活性类似于游离Dox。Rodrigues等通过酸敏感型腙将Dox腙酰亚胺衍生物与末端为硫醇基的mPEG(相对分子质量为20000)连接形成前药,以期在经过细胞溶酶体内吞后的酸性条件下腙键降解,释放出游离Dox。体外细胞培养时,发现含有腙键的缀合物对血癌细胞BXFT24和肺癌细胞LXFL529L有抗癌活性,而以不能降解的酰胺键结合的缀合物则无活性。抗肿瘤常用药紫杉醇也通过此种方式制备了紫杉醇-腙酰亚胺衍生物,体外水解释放时发现,该缀合物在pH4.0时,半衰期为17～28h,但pH7.4时释放较慢,48h后释放不到10%,但其对人肿瘤细胞的细胞毒活性却远远不如游离原药,降低了95%～97.5。Sedlák等将两性霉素B(amphotericinB,AMB)用PEG(相对分子质量分别为5000,10000和20000)修饰后研发了新型的AMB注射剂,利用末端被醛基取代的PEG以酸敏感性的醚键,亚胺键,酯键与AMB结合,以期在pH较低的环境下释放出AMB发挥抗菌作用。体外药动学发现,所有缀合物在37℃,pH7.4的磷酸盐缓冲液中相对稳定,24h释放不到5mol%。用37℃,pH5.5的磷酸盐缓冲液模拟病变部位的环境,这些缀合物释放AMB的半衰期为2～45min。急性毒性实验中,通过酯键连接的前药(相对分子质量分别为10000和5000)的LD50分别为20.7mg·kg-1和40.5mg·kg-1,表明其毒性比游离的AMB减小了83.3%～90.9%。以上实验表明,经酸敏感性的连接臂合成的PEG能够达到控制释放的目的,与此同时还可以减小AMB的不良反应。1.2.2药物的释放特性此种类型的连接臂使缀合物可以在血液中保持稳定,但是当缀合物通过内涵体进入细胞时,所处的环境中由于溶酶体中特异性酶的存在可以使缀合物酶解,释放出原药。美沙拉嗪(mesalazine,SA)是治疗溃疡性结肠炎的常用药,但是经口服后容易被上消化道迅速吸收而很少到达结肠黏膜发挥药效,并且该药物还有导致肾病综合征的不良反应。因此,Canevari等采用mPEG为载体,以氨基苯甲酸作中间体,制备了通过偶氮键连接的PEG前药。其体外释放特性研究表明,此前药在人工胃液和胰液中稳定性好,而在结肠组织的裂解液中则释放相对较快。体内药代的研究中,在结肠黏膜和血浆中前药组的SA含量明显高于SA组。这表明经过PEG修饰之后,SA表面的位阻增大,阻止了其在上消化道的吸收,直到结肠部位偶氮还原酶将连接PEG与SA之间的偶氮键水解后才逐渐释放出SA,使药物在特定的部位吸收利用。体内药理实验中结肠组织切片也表明前药组较SA组更能显著减弱其发炎溃疡程度。1.2.3peg-dnr药物的合成此类连接臂通常应用在双前药系统中,这类前药裂解时首先在连接臂1催化下,将前药水解为载体、连接臂2-药物,生成第2个前药,此前药再最终水解释放出原药。这种连接臂主要包括2种:1,6或1,4-苄基消除(benzylelimination,BE)系统(图1)和三甲基内酯化(trimethyllactonization,TML)系统(图2)。BE系统的第一步裂解往往是通过酶解将前药裂解成载体PEG和连接臂2-药物(前药2),然后前药2在邻位取代的苄基作用下迅速水解,释放出原药。运用BE系统合成的PEG-柔红霉素(daunorubicin,daunomycin,DNR)系列前药的抗肿瘤效果明显较DNR强,而且其血浆半衰期为2～4h,这是不引起毒性反应而又能够抑制肿瘤生长的最佳时间。经过BE系统制备的注射式水溶性PEG-6-巯嘌呤(6-MP)前药不仅使其巯基受到了保护,而且缀合物在pH7.4的PBS缓冲液中能够长期保持稳定,在大鼠血浆中水解时间也延长。与游离的6-MP相比,缀合物对于小鼠白血病以及某些实体瘤具有显著疗效(P<0.05),并有可能开发出6-MP注射剂。类似于BE的TML也已被应用于PEG修饰技术中。Greenwald等采用TML系统通过不同的连接臂制备了一系列PEG-DNR的产物。这些产物在37℃,pH7.4的PBS中均较稳定,释放时间达到24h以上。同时作者发现不同位阻产物之间的特性相差极大,因此连接臂上的位阻大小是TML环合前药特性的关键。在体内抗肿瘤实验中,对于SKOV3肿瘤细胞,PEG-DNR的抑瘤效果均比BE系统合成的前药及游离的DNR强,表明TML系统是一种较为优越的PEG修饰和药物运输方式。这几种连接方式均是建立在药物分子具有氨基的基础上通过酯和酰胺等方式合成,这也为其他药物的PEG修饰提供了参考。上述文献结果表明,通过双前药的方式,改变连接臂能够使PEG前药取得更加显著的药效。1.2.4羟基封闭n-曼尼希碱对大鼠血浆中游离羟基的影响除以上所述的连接臂之外,近年来还有少数新型的连接臂。Zhao等分别以羟基游离(O-free)及羟基封闭(O-blocked)水杨乙酰N-曼尼希碱为连接臂,合成了PEG负载的蒽环霉素类抗癌剂(图3)。其体外药动学表明,在磷酸盐缓冲液和大鼠血浆中,通过羟基游离N-曼尼希碱合成的PEG前药的t1/2不到1h,而由羟基封闭N-曼尼希碱合成的PEG前药却相对稳定,其t1/2在12h以上,表明由羟基游离N-曼尼希碱合成的前药水解时分子内部的游离羟基起了重要作用;药物进入体内时,封闭羟基的甲酰基迅速被血浆中的酯酶水解,游离羟基被释放后促进原药的释放。体内的药动学研究表明,羟基封闭N-曼尼希碱合成的PEG-Dox前药的清除率为6.62ml·min-1,远远低于游离的Dox(120ml·min-1),前药的半衰期明显延长。体内抗癌活性实验中,羟基封闭N-曼尼希碱合成的PEG-Dox前药的抑制肿瘤生长的作用达到59%,而Dox原药为44%。1.3peg的相对分子质量PEG是获得FDA认可的并被中、英、美等多个国家药典收载的药用辅料,长期以来,在注射剂、滴眼剂和胶囊剂等多种剂型中有着广泛应用。PEG用于药物的运输系统可以明显地改善药物的体内代谢特征及药物自身缺陷。目前研究发现,用于修饰药物的PEG分子量的大小对药物在体内的代谢途径和清除速度影响较明显。1994年Yamaoka等就对静脉注射不同分子量的PEG后组织摄取与分布特性进行了系统地研究。结果表明,肾清除率随着PEG相对分子质量的增加而降低,在相对分子质量为30000时发生明显的转变,PEG在血浆中的半衰期也随之发生明显变化。当PEG相对分子质量从6000增加到190000时,半衰期从18min延长到1d。Gursahani等研究了相对分子质量550～20000的PEG用FITC标记后在肺部渗透特性的差别。结果表明,PEG分子量不同,肺部摄取的速率也有很大差别,分子量从550依次增大到20000时,半衰期也从2.4h延长到了13h。相对分子质量小于5000的PEG-FITC在48h内即被清除,而相对分子质量大于5000的PEG-FITC能够在肺泡及肺部组织中保留7d。这表明PEG的相对分子质量对药物的释放和吸收机制有着重要影响。低分子量的PEG(相对分子质量<20000)负载药物虽然可以改善药物水溶性等,但是对其半衰期及药效影响不大。Greewald等1994年制备了水溶性2′-紫杉醇-PEG(5000),在体外药动学研究发现其具有前药的释药特性:在pH7.5的PBS缓冲溶液中,其半衰期为5.5h;而其在体内药动学研究中却没有表现此特性,半衰期仅约1h,说明这种修饰方式对体内药物代谢影响不大。但是连接了PEG后的紫杉醇水溶性大大提高,而且体外急性毒性实验证明其不良反应也较紫杉醇改善了很多。高分子量的PEG药物(分子量>20000)因为具有EPR效应,可增强疗效,因此成为目前PEG修饰常用的载体。另外高分子量的PEG还可以阻止药物在体内过快清除。例如,CPT与相对分子质量为40000,20000,8000的PEG连接而成的缀合物通过静脉注射的方式给药后,表现出不同的致死率分别为50%,10%和0%,此结果是由不同PEG分子量在体内的分布、代谢和清除的不同引起的:PEG(8000)组给药后6min就可以被清除,而PEG(20000)和PEG(40000)组分别需要24h和96h。鉴于大分子量PEG对药物代谢的影响,大多数用于药物修饰的PEG载体分子量均大于30000,目的就是阻止PEG缀合物在体内的过快地消除,达到长期缓释的作用。但是需要注意的是,大分子的PEG修饰药物并不一定都能够使药物的药效增加。鬼臼毒素(podophyllotoxin,Podo)与PEG连接后药物活性并没有很大提高,这也与Podo本身的抗癌机制以及前药在体内长期释放引起的毒性不良反应有关。因此,在用PEG修饰药物的研究中,应该系统全面地比较各种影响因素对药物疗效的影响。随着PEG的应用范围的扩大,PEG分子不再局限于末端是羟基的直链结构,为了提高载药量,树枝状和双官能团PEG等多种类型的PEG衍生物已经出现,并且也逐渐地应用于药物运输系统,使得PEG修饰修饰技术不断完善,应用范围不断扩大。喜树碱类新药伊立替康(irinotecan)的活性代谢物7-乙基-10-羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydroxycamptothaci,SN38)是一种具有广泛应用前景的广谱抗肿瘤新药,其细胞毒性是伊立替康的100～1000倍。但是SN38同样存在水溶性差的问题,运用常规的给药方式存在一定困难。Zhao等采用了拥有4个连接基团的“多臂”PEG来负载SN38以增加载药量,使其载药量达到3.7%,明显高于PEG伊立替康的载药量1.7%。产物的水溶性为120～180g·L-1,相当于SN386.7g·L-1,这比原药SN38的水溶性(0.0072g·L-1)提高了400～1000倍;体外细胞培养实验证明,其抗癌活性与SN38相当,比伊立替康提高了6.5～666倍;在移植MX-1肿瘤的小鼠体内,其肿瘤生长抑制率达99%,并且合成产物PEG-甘氨酸-(20)-SN38已经确定进入临床前实验。2小分子药物peg修饰运用PEG修饰小分子药物虽然有其独特的优势,但是也存在不少缺陷。①就PEG本身来讲,PEG是化学合成的产物,虽然其相对分子质量的分布指数(1.01～1.10)较其他药物载体小,但是也存在着不均一的缺陷,这给药物合成时不同批次产物的统一性带来了一定困难。近年来,由于合成和纯化技术的改进,市场上的PEG产物纯度已经得到改善,但是在PEG负载小分子的研究中,这一问题仍然值得重视。②PEG对所修饰的药物分子选择性高,一方面用于PEG修饰PEG分子一般只有1个或2个基团,而小分子药物的活性基团也相对较少,这使两者之