张洪渊第四章第六节蛋白质分离纯化

一、一般原则及基本步骤材料的预处理及细胞破碎蛋白质的抽提蛋白质的粗分级等电点沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法蛋白质的细分级凝胶层析法离子交换层析法亲和层析

第六节蛋白质的分离纯化与测定二、蛋白质的分离纯化方法

（一）根据分子大小不同的纯化方法

（二）利用溶解度差别的纯化方法

（三）根据电荷不同的纯化方法

（四）利用选择性吸附的纯化方法

（五）利用配体的特异性亲和力的纯化方法

（一）根据分子大小不同的纯化方法

1.透析和超滤

2.密度梯度离心

3.凝胶过滤1.透析和超滤半透膜袋蛋白质溶液透析液磁棒磁力搅拌器

透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。常用的半透膜：

玻璃纸（赛璐玢纸，cellophanepaper）

火绵纸（赛璐玎纸,celloidinpaper）

其他改型纤维素材料超过滤（ultrafiltration）

利用压力、抽滤（A）或离心力（B）等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。滤膜有多种规格，可选择性的截留相对分子量不同的蛋白质。为了避免被膜截留的蛋白质在膜表面上堆积，现常用截向流过滤的方法，即液体在泵驱动下沿着与膜表面相切方向流动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部分液体切向地流过表面将被膜截留的蛋白质分子冲走。滤膜抽气滤膜离心AB2.密度梯度离心法（densitygradient）

生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。滴加样品离心管蔗糖密度梯度蔗糖浓度3.凝胶过滤

原理：凝胶层析也称为排阻凝胶层析、凝胶过滤和分子筛层析。它是60年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。由于被分离物质的分子大小（直径）和形状不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。应用测定分子量分子筛层析原理示意图分子筛层析与洗脱曲线

凝胶颗粒收集蛋白质管蛋白质混合物大分子从柱上面加缓冲溶液小分子洗脱体积（Ve）凝胶柱大分子小分子Ve1Ve2V0蛋白质Mr=49,000洗出液中的蛋白质浓度洗脱体积（mL）未知logMr洗脱体积与相对分子质量的关系

Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“选择性曲线”G-200G-100logMrKav（二）利用溶解度差别的

纯化方法

1.等电沉淀和PH控制

2.蛋白质的盐溶和盐析

3.有机溶剂分级分离

4.温度对蛋白质溶解度的影响1.等电沉淀和PH控制蛋白质处于等电点。其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。在等电点以上或以下的pH时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而相互排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。在其等电点(pH5.2-5.3)时达到最低值，在等电点两侧的pH下，其溶解度迅速上升；不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调至蛋白质混合物中某种成分的等电点pH时，这种蛋白质的大部分或全部将沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中这样沉淀出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。2.蛋白质的盐溶和盐析低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶(saltingin),盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。表明中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响。3.有机溶剂分级分离（1）有机溶剂可以使蛋白质沉淀主要有乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。（2）有机溶剂可以破坏水化膜、造成一个低介电区。（3）有分级分离现象（4）要求对有机溶剂低温预冷。4.温度对蛋白质溶解度的影响在一定温度范围内，约0-40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，例如人的血红蛋白从0到25℃，溶解度随温度上升而降低。在40-50℃以上开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低的温度下进行。（三）根据电荷不同的纯化方法

1.电泳

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.毛细管电泳

4.等电聚焦

5.层析聚焦

6.离子交换层析1.电泳电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gelelectrophoresis）。凝胶可以是淀粉凝胶（starchgel）、琼脂糖凝胶（agarosegel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel）。一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。电泳技术分类垂直板电泳毛细管电泳水平板电泳电泳支持物滤纸凝胶薄膜圆盘电泳2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,简称PAGE)，也称圆盘凝胶电泳或圆盘电泳(discgelelectrophoresis)，它是在区带电泳的基础上发展起来的。它以聚丙烯Ift胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板，凝胶是由相连的二部分组成（小的部分是浓缩胶，大的部分是分离胶），这二部分凝胶的浓度（孔径大小）、缓冲液组分和离子强度,pH以及电场强度都是不同的，即不连续的。这样,电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的起始区带（厚度约为0.1mm），然后再进行电泳分离。PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N，N

-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化剂的作用下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。化学聚合:催化剂过硫酸铵(AP)，加速剂TEMED光聚合:催化剂核黄素，加速剂TEMED

不连续PAGE三种效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应3.毛细管电泳

毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（

2-75μm）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是90年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、DNA序列测定及PCR产物的分析鉴定等。毛细管电泳原理示意图毛细管电泳检测技术的发展毛细管电泳分离模式的发展4.等电聚焦（isoelectricfocusing）原理:

在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其pI相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：

高效率分离纯化蛋白质测定蛋白质分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+线性梯度5.聚焦层析（Chromatofocusing）该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时,由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中,一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的时间进行聚焦,剩余样品还可以加到柱上,其聚焦过程都能顺利完成。pH梯度溶液的形成示意图蛋白质1（pI=7）蛋白质2（pI=8）流速移动速率层析时的聚焦效应示意图6.离子交换层析

（ion-changechromatography）

原理基质疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂应用制备纯化生物物质定量、定性测定混合物中各组分1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离子进行交换3、4.解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用12345原始缓冲溶液的反离子样品溶液梯度浓度离子交换层析原理示意图

蛋白质浓度洗脱体