劳倦加饮食不节复合腹腔注射链脲佐菌素复制2型糖尿病动物模型

劳倦加饮食不节复合腹腔注射链脲佐菌素复制2型糖尿病动物模型

成功建立2型糖尿病动物模型（ii类、亚甲基物种、t2dm）是研究t2d的基础和必要的基础。目前T2DM的基础研究多选用大鼠模型,按照造模方法一般将T2DM鼠类模型分为三类,即遗传型模型、喂养型模型和药物型模型。本实验以期建立一种经济、可靠、易于操作、成模周期短、更适合用于研究T2DM机制的动物模型,同时在中医药理论指导下,采用传统中医学病因复制证候动物模型,令动物模型同时具有疾病与证候特征。本课题拟探讨建立病证结合T2DM动物模型的方法,提出了研究的新方法和新思路。1材料表面1.1动物证件号:scxk健康雄性Wistar大鼠60只,体重(220±20)g,由辽宁中医药大学教学实验中心提供(动物合格证号:SCXK(辽)2004-0018)。实验前大鼠适应性喂养1天,自由饮水,无不良反应、进食、饮水和活动正常者纳入实验。1.2实验饲料高脂饲料配方:2%胆固醇,丙硫氧嘧啶,20%砂糖,10%玉米油,8%蛋黄粉和60%基础饲料混合而成。1.3实验室管理辽宁中医药大学教学实验中心动物实验室,室内自然采光,通风良好,实验室全程保持室温(20±3.0)℃,湿度40%,明暗周期12h。1.4化学试剂及试剂人胰岛素(INS)ELISA试剂盒:美国ADL公司批号:RT110371。胆固醇:国药集团化学试剂有限公司,编号:69008214,批号:F20061011。链脲佐菌素:北京邦定泰克生物技术公司,批号:STZ-S0130。1.5全自动生化仪器电子天平(大连星海电子衡器有限公司MODE-LDS-671);全自动生化分析仪(日本日立7600型);TG16-WS台式高速离心机(湘仪离心机仪器有限公司);全自动血糖仪(强生稳豪倍优型);数字体温计(欧姆龙MC-612)。2方法2.1实验组按体重随机分成两组:空白对照组(n=20)和模型组(n=40)。2.2单次注射缓冲液单日喂食甘蓝15~20g/只,自由饮水;游泳至耐力极限。双日高糖高脂膳食持续喂养。共计12周。第4周后将链脲佐菌素以无菌枸椽酸钠缓冲液配制成2%的溶液(pH=4.2),以53mg/kg体重单剂量腹腔注射。(1)脾气虚证的评估标准:(1)体毛光亮度减退;(2)倦怠,懒动;(3)粪便时软、时塘;(4)游泳耐力下降。(2)糖尿病的评估标准:(1)体重增加;(2)空腹血糖;(3)餐后血糖增高;(4)胰岛素抵抗。具备以上4项组成成分中的3项或全部者即可诊断为脾气虚证T2DM成功模型。2.3样品采集标本采集前禁食12h,空腹眶后静脉取血,以3000r/min,4℃离心10min分离血清,分别送检。2.4测试项目和方法2.4.1一般观察2.4.2血糖值2.4.3甘油和总胆固醇2.4.4空腹血清胰岛素菲尼克斯2.4.5胰岛素敏感指数isi采用李光伟计算方法,以空腹血糖与空腹胰岛素乘积倒数的自然对数来表示,即ISI=Ln1/(FPGoFINS)。2.5统计分析方法采用IBMSPSSStatistics19软件包进行统计分析。各组实验数据采用均数±标准差(ue0af±s)表示。各组数据平均数之间的差异采用单因素方差分析。P<0.05时判定差异有显著性。3结果3.1基站结果显示,造模组与正常对照组在实验初始时在体重,血糖和血脂方面组间均无统计学差异,基线水平齐。3.2体毛亮度下降模型组从第4周后,表现为食少懒动,体重增加,大便溏薄,异味重,精神萎靡不振,体毛光亮度减退,游泳耐力逐日下降。正常对照组体重逐日递增,食欲好,活动正常,大便正常,背毛光泽,反应灵活。3.3体重变化结果显示,模型组大鼠体重与正常对照组相比,逐渐增加,从第6周开始两组之间存在差异。3.4两组治疗前后血压变异结果显示,模型组大鼠空腹血糖与正常对照组相比,从第6周开始两组之间存在差异。结果显示,模型组大鼠餐后2h血糖与正常对照组相比,从第6周开始两组之间存在差异。3.5两组对比结果显示,模型组大鼠甘油三酯与正常对照组相比,明显增加,两组之间存在差异。结果显示,模型组大鼠高密度脂蛋白与正常对照组相比,明显降低,两组之间存在差异。3.6胰岛素和胰岛素的敏感指数增加结果显示,模型组大鼠血清胰岛素与正常对照组相比,胰岛素敏感指数显著下降,两组之间存在差异。3.7大鼠死亡时骨科改变根据模型评估标准,因模型评估不达标而剔除2只,并先后有3只大鼠死亡,尸体解剖没有发现异常,推测可能与游泳后未及时将大鼠擦干,导致大鼠着凉,体质减弱,对链脲佐菌素耐受性差等有关。其余大鼠均符合成模标准,成模大鼠总共35只,成模率为87.5%。4高糖高脂饮食诱导tm模型实验根据中医学理论,以劳倦加饮食不节等复合因素,造成脾气虚证T2DM模型。模型组出现了游泳耐力逐日下降,食少懒动,大便溏薄,精神萎靡不振,体毛光亮度减退,从第6周后体重,空腹血糖、餐后血糖增高就开始显著增加,甘油三酯和总胆固醇分别从第4周后表现出异常。造模结束后模型组出现高血糖,高胰岛素血症、胰岛素抵抗,符合本研究拟建立的脾气虚证、T2DM的评估标准。实验成功地复制与人类相似的脾气虚证T2DM大鼠模型。临床上T2DM通常伴有血脂异常,因此我们在诱导T2DM动物模型时先给予高糖高脂饮食喂养一段时间诱导成胰岛素抵抗,而后再给予STZ腹腔注射。并且文献报道高糖高脂饮食喂养大鼠的胰岛β细胞对STZ敏感性显著增强,并且STZ注射后对动物模型血脂的升高有增强作用。这种造模方法不仅改善了单纯STZ注射成模率低的问题,也解决了单纯高能量饲料喂养诱导时间很长的难题。目前,有关高糖高脂饮食诱导T2DM模型的机制还不是很清楚,PagliassottiMJ等认为高糖可能造成体内的氧化损伤,其促氧化效应可引起血糖或葡萄糖耐量异常。同时高碳水化合物饮食可刺激肝脏脂肪的生成,提高血清中甘油三酯的水平,从而引起酯酰辅酶A的升高,升高的酯酰辅酶A增加了脂肪组织中饱和脂肪酸的含量,而脂肪组织中饱和脂肪酸与降低骨骼肌中胰岛素的活动有关。可见脂代谢的紊乱可影响糖代谢中胰岛素的分泌,引起糖代谢紊乱。Wilkes等认为高脂饮食直接降低胰岛素作用下骨骼肌和脂肪组织对葡萄糖的吸收作用