中药冬虫夏草-薄荷脑低共熔物对神经毒素纳米粒鼻腔给药吸收入脑的影响

中药冬虫夏草-薄荷脑低共熔物对神经毒素纳米粒鼻腔给药吸收入脑的影响

纳米药物载体系统具有许多作用，如靶场、缓冲和保护药物。前期实验表明:纳米粒作为神经毒素(neurotoxin,NT)的载体,既能保持药物的活性,又能增加药物的脑内含量。临床上,NT主要的给药方式为肌内注射,但起效慢(3~5h),难以满足临床要求。鼻腔给药是近年来研究较多的有望成为多肽类药物注射给药替代途径的新型药物传输系统之一。但鼻腔黏膜吸收能力有限且清除较快,因此可以通过加入吸收促进剂来提高NT的生物利用度。冰片和薄荷脑是近年来研究较多的中药吸收促进剂。冰片具有“芳香走窜,引药上行”之效,能有效改善鼻黏膜与血脑屏障(bloodbrainbarrier,BBB)的通透性,提高药物脑内浓度。薄荷脑具有较强的促渗作用,对水杨酸等多种药物具有良好作用。将冰片、薄荷脑制成低共熔混合物可以显著增加促渗作用,提高药物疗效,减少药物用量。本课题组前期工作中制备了体外性质良好的神经毒素纳米粒;建立了以微透析技术为平台测定脑内药物变化的方法,为中药吸收促进剂的筛选与考察奠定了良好的基础。1材料表面1.1实验分子和试剂神经毒素:中国科学院昆明动物研究所蛇毒研究中心(纯度≥99%,相对分子质量6700);125I-NT(1.38g·L-1;1.99×108Bq;纯度大于99%,标记率97%):复旦大学药学院放射药学教研室协助标记和检测;聚乳酸(PLA):瑞士Fluka公司(相对分子质量25万;批号WA18975);冰片:Sigma公司(纯度≥8.0%;批号464-43-7);薄荷脑:Sigma公司(纯度≥98.5%,批号89-78-1)。冰片薄荷脑低共熔物(实验室自制,即将冰片与薄荷脑以1∶3的比例进行研和均匀);泊洛沙姆(pluronic,F68,德国BASF,批号WPDX5776);戊巴比妥钠(中国医药集团上海化学试剂公司,批号WS20050711);碘化钾(宁波市化学试剂厂,批号XK13-005-1008-21);饱和碘化钾溶液:实验室自制。1.2微透析探针、加标剂和冷冻干燥机SN-695B型智能放免γ测量仪:上海原子核研究所日环仪器一厂;脑微透析仪:美国BAS公司;微透析探针:MD-2200,外径0.5mm,膜长2mm,截留相对分子质量为38×103;采用自制鼻腔给药装置:专利(专利号ZL200520013524.0);冷冻干燥机(LABCONCO,England);JY92-ⅡD型超声波细胞破碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。1.3动物SD大鼠,雄性,体重(320±20)g,由浙江大学医学院动物实验中心提供。2方法2.1bo/me-nt-nt-np的制备采用实验室已优化的制备方法:称取50mgPLA溶于1.0mL醋酸乙酯中,加入50μL冰片-薄荷脑低共熔物(BO/ME)(冰片组加等量冰片、薄荷脑组加等量薄荷脑、空白组不加),形成有机相(O),再将50μL1.0g·L-1的NT水溶液(W1)加入到有机相中,涡旋乳化30s形成初乳溶液(W1/O),将2mL0.5%胆酸钠水溶液加入到初乳溶液,冰浴下探头超声乳化36s(90W)得复乳溶液(W1/O/W2),复乳分散到100mL0.5%泊洛沙姆(pluronic,F68)水溶液中,并在真空条件下,40℃下旋转蒸发除去有机溶剂,最后4万r·min-1超速离心30min,所得沉淀冻干即得BO/ME-NT-NP。2.2术后管理和护理参考LI等方法:SD大鼠戊巴比妥钠(45mg·kg-1)腹腔注射麻醉,固定于脑立体定位仪上。按大鼠脑图谱,确定PAG部位(前囟后7mm,脑表面下5mm,中线旁开0.8mm),将脑微透析探针埋植于右侧PAG腹外侧中,固定探针,缝合。术后5d不予实验,将大鼠放置于标准环境温度(22±2)℃;相对湿度(60±10)%;昼夜12h人工交替;自由饮食和饮水)中生活,作为大鼠手术后生理恢复阶段。实验前24h禁食但可自由饮水,并用饱和碘化钾溶液灌胃(100mg·kg-1)以饱和甲状腺。实验结束后,猝死大鼠,对大脑进行冷冻切片观察针道,位置不正者,该组数据弃去。2.3透析液根据文献,采用反渗透法测定脑微透析探针在体回收率。取微透析手术完成恢复后的SD大鼠,戊巴比妥钠(45mg·kg-1)腹腔注射麻醉,俯状固定于大鼠实验板上,取出管心针,将微透析探针插入微透析底座中,在大鼠PAG部位用含5,25,50ng·mL-13种不同浓度的125I-NT的灌流液灌流,流速2μL·min-1,收集间隔时间为15min,总时间1.5h。第1次和最后1次收集的透析液不作参考。测定每个收集时间点透析液中125I-NT的浓度。在体内反透析过程中,由于125I-NT在脑组织中具有较高的扩散能力,所以假设探针周围脑组织间液(braininterstitialfluid,BIF)中的NT浓度为零(CBIF=0)。体内回收率计算公式:回收率=Cdialysate−CperfusateCperfusate−CBIF×100%(1)Cdialysate和Cperfusate分别为灌流液和透析液中NT的浓度,CBIF为周围脑组织间液中NT的浓度。2.4实验大鼠血清中t-np-等神经毒素纳米粒的检测,并将nt取SD雄性大鼠20只,随机分成四组进行鼻腔给药:添加冰片/薄荷脑低共熔混合物吸收促进剂的神经毒素纳米粒(NT-NP-Ⅰ)、不添加吸收促进剂的神经毒素纳米粒(NT-NP-Ⅱ)、单独添加冰片吸收促进剂的神经毒素纳米粒(NT-NP-Ⅲ)、单独添加薄荷脑吸收促进剂的神经毒素纳米粒(NT-NP-Ⅳ)(每只大鼠给药相当于NT60μg·kg-1,冰片0.11mg·kg-1,薄荷脑0.38mg·kg-1)。实验时将微透析探针植入微透析底座,探针通过PE管与微量泵相连,30min后,向探针内灌注人工脑脊液,流速2μL·min-1。平衡30min后进行鼻腔给药。于给药后每隔15min收集一次透析液30μL,采用自动恒温(-4℃)冷冻收集器连续收集5h,置于收集样品的专用小试管中,并置于4℃冰箱中保存,待测放射性强度(cpm),并折算成NT实际浓度。利用公式(2)校正,得到各时间点NT实际浓度,并用药动学软件计算各参数。NT实际浓度=NT测定值回收率(2)3结果3.1zeta电位所得纳米粒大小均一、表面光滑,平均粒径为106.8nm,Zeta电位-28.40mV,包封率为70.60%。制备得到的冻干品每克中冰片含量为14.60mg,薄荷脑含量为50.67mg。3.2平均体内回收率脑微透析探针插入PAG部位,125I-NT的平均体内回收率(丢失)为12.6%(SD±1.2%)。NT的体内回收率(丢失)用于透析部位PAG的透析液中的实际药物浓度的校正。3.3药动学参数分析不同吸收促进剂NT纳米粒经大鼠鼻腔给药后平均脑内药物浓度-时间曲线见图1,药动学数据用3P97软件进行拟合,结果PAG中NT的动力学过程符合二室模型,药动学参数见表1。由结果可知,添加中药吸收促进剂(低共熔物、冰片或薄荷)的纳米粒可显著增加NT入脑的程度与速度,而应用冰片-薄荷脑低共熔物则显著优于单纯应用冰片或者薄荷脑。4中药吸收促进剂用量对合成纳米粒和药物生物利用度的影响实验室前期工作成果表明,单独使用NT鼻腔给药后,NT几乎不能入脑吸收,而将NT制成纳米制剂,实验结果NT-NPs-Ⅱ能使药物透过血脑屏障入脑,并具有一定地缓释作用。但是NT吸收量较少,生物利用度较低。本课题采用中药吸收促进剂修饰纳米粒进行鼻腔给药,不6932525间。其原因可能是BO/