银杏内酯b衍生物抗血小板聚集的药效学研究

银杏内酯b衍生物抗血小板聚集的药效学研究

大多数心血管疾病的发生以动脉硬化性血栓形成为基础，包括稳定和不稳定型心绞痛、急性心脏病、局部缺血性中风和周围动脉阻塞。血小板在动脉粥样血栓形成的各个阶段都扮演着重要角色。血小板黏附、聚集、释放反应可导致血栓形成。因此抑制血小板聚集在治疗心血管疾病中发挥着极其重要的作用。PAF是迄今发现的最强的血小板聚集诱导剂,是TXA2的200倍,ADP的500倍。银杏内酯B为银杏叶中的二萜内酯类化合物,是血小板活化因子特异性受体拮抗剂。由于银杏内酯B水溶性极小,临床作为注射剂使用受到一定的限制。通过合成银杏内酯B衍生物(XQ),解决了其水溶性低的问题。但XQ是否具有与银杏内酯B相似的药理活性?本文从抑制血小板聚集这一角度进行了初步研究。1材料表面1.1为白色结晶体的固体培养基银杏内酯B衍生物(XQ)、银杏内酯B,均为白色结晶体,南京柯菲平医药科技有限公司提供;曲克芦丁注射液,天津药业焦作有限公司(批号:05072721)。1.2siga和adp柠檬酸钠购自上海化学试剂研究所(批号:20000410);血小板活化因子(PlateletActivatingFactor,PAF)购自SIGMA公司(批号:055K5200);花生四烯酸(ArachidonicAcid,AA)购自SIGMA,(批号:125K2600);4,5’-腺苷二磷酸二钠盐(AdenosineDiphosphate,ADP)购自SIGMA公司(批号:A-2754);酸溶性胶原(Collagen,COL)购自SIGMA公司(批号:095K3781);冰乙酸购自上海久亻意化学试剂有限公司(批号:20041026);无水乙醇购自上海试剂一厂综合经营公司(批号:20011215);磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSaline,PBS)购自中杉金桥。氯化钠注射液购自南京小营制药有限公司(批号:2005090101);盐酸普鲁卡因注射液购自上海旭东海普药业有限公司(批号:001201)。1.3实验动物新西兰家兔,由江宁县汤山青龙山动物繁殖场提供,实验动物生产许可证:SCXK(苏)2002-0027。1.4血小板聚集及血凝测定JA-1203上皿电子天平,上海天平仪器厂。PAPER-I型血小板聚集及血凝测定仪,北京世帝科学仪器公司。LDZ5-2离心机,北京医用离心机厂。XSP-13型光学显微镜,南京江南光学仪器厂。2方法和结果2.1方法2.1.1血小板的检测取体质量2.2～2.5kg雄性新西兰家兔,皮下注射1%盐酸普鲁卡因注射液局部浸润麻醉。颈动脉取血,制备富血小板血浆(RPR)和贫血小板血浆(PPP)。用PPP调节PRP的血小板数,使成360×109/L。取已调节的PRP血浆250μL,分别加入不同浓度的药液10μL,并立即用PAF(0.01mg/mL)、ADP(0.144mg/mL)、AA(2mg/mL)、COL(0.01mg/mL)各10μL进行诱导,测定血小板最大聚集率。计算半数抑制浓度(IC50)。2.1.2给药及给药剂量取雄性新西兰家兔48只,体质量2～2.3kg,随机分为6组:①空白对照组:0.9%氯化钠注射液;②曲克芦丁组:24mg/kg;③XQⅠ组:0.1125mg/kg;④XQⅡ组:0.225mg/kg;⑤XQⅢ组:0.45mg/kg;⑥XQⅣ组:1.8mg/kg。各组每日静脉给药1次,连续给药3日。末次给药后30min,同2.1.1方法制备RPR和PPP。然后分别用PAF、ADP、AA、COL诱导剂进行诱导,观察XQ对血小板聚集的抑制作用。2.2结果2.2.1血小板聚集的抑制作用结果见表1。表1实验结果显示:XQ对PAF、ADP、AA、COL诱导的血小板聚集均有抑制作用,其中对PAF、ADP、AA、COL诱导的血小板聚集的抑制作用呈明显的量效关系(R分别为0.893、0.786、0.906、0.922);银杏内酯B对PAF、ADP、AA、COL诱导的血小板聚集也均有抑制作用,其中对PAF、ADP、AA、COL诱导的血小板聚集的抑制作用呈明显的量效关系(R分别为0.812、0.697、0.753、0.717)。2.2.2对paf、adp、aa、col诱导的血小板聚集的影响结果见表2。表2结果显示:XQ(0.225、0.450、1.800mg/kg)对PAF、ADP、AA、COL诱导的血小板聚集均有抑制作用,与空白对照组比较有显著差异(P<0.05,0.01)。3曲克芦丁的作用机制实验结果发现,XQ体内外给药对PAF、ADP、AA、COL诱导的血小板聚集均有抑制作用,其中对PAF诱导的血小板聚集的抑制作用最强,且体外PAF的IC50接近或略低于银杏内酯B,而对ADP、AA、COL的IC50则高于银杏内酯B,表明XQ对PAF具有更强的专一性。有报道,银杏内酯B对血小板膜上的PAF受体有较强的亲和力,为PAF受体的拮抗剂,因此认为XQ抑制血小板聚集的作用是通过拮抗PAF受体而实现的。XQ作为银杏内酯B的衍生物,增加了水溶性,并仍然保持相似的生物活性,若作为新药注射液开发具有一定的市场前景。曲克芦丁体外给药对ADP、AA、COL诱导的血小板聚集有抑制作用,体内给药对PAF、ADP、AA有抑制作用,表明曲克芦丁的作用机制与银杏内酯B不完全相同。曲克芦丁系芦丁经羟乙基化制成的半合成黄酮化合物,具有增加红细胞和血小板表面电荷密度,抑制红细胞和血小板聚集,加强体内纤维蛋白溶解活性,对抗5-羟色胺缓激肽等引起的血管损伤,因此推测曲克芦丁可能是5-HT受体拮抗剂。血小板活化因子(PAF,1-O-alkyl-2-acetylsn-glycero-3-phosphocholine)是一个有效的炎症介质,其参与许多人类的病理生理调节机制;也是最强的内源性血小板聚集促效剂。最近许多实验数据显示PAF参与了动脉粥样硬化的关键性调节。PAF的生物学效应是由特异的PAF受体所介导的。目前尚不完全清楚,其细胞内信号转导机制,可能机制为:①由偶联蛋白(G蛋白)、磷脂酶C(phospholipaseG,PLC)或腺苷酸环化酶(adenylatecyclase,AC)组成PAF受体转导蛋白,通过活化G蛋白(Gp,Gq)激活磷脂肌醇特异性PLCβ,催化质膜磷脂肌醇水解,生成第二信使IP3(inositoltriphosphate)和DAG(diacylglycerol),前者使Ca2+从细胞内钙池释放,使胞浆Ca2+浓度增加,后者可激活PKC(proteinkinaseC),使其对Ca2+和磷脂的亲和性加强,进而刺激蛋白底物磷酸化,引起特定效应;②通过Gi蛋白抑制AC,减少cAMP的生成;③通过酪氨酸激酶活化PLCγ,PLD(phospholipase