小麦可溶性非淀粉多糖的单糖组成分析

小麦可溶性非淀粉多糖的单糖组成分析

1生物功能分析小麦非物质糖（nip）作为功能糖的重要组成部分，与阿拉伯的木聚糖（nip）一起，具有排便、降血脂、抗结肠癌、肿瘤、增加活力等生理功能。NSP的单糖组成的测定是参考Englyst等(1992)方法,多糖经2mol/L硫酸水解成单糖后,经NaBH4还原,用l-甲基咪唑作催化剂和乙酸酐在室温条件下反应生成糖醇乙酸酯,利用糖醇乙酸酯易挥发的特性,用气相色谱毛细管柱进行分离,火焰检测器测定。2实验部分2.1小麦麸皮可溶性nsp的提取按Choct和Annison(1990)的方法分别用水和0.2mol/L氢氧化钠作溶剂从小麦麸皮中提取出2种可溶性NSP(分别是水提取NSP和碱提取NSP)待测。2.2试剂的制备2.2.1苯甲酸溶液se称取100mg阿洛糖(D-Allose,AR级,美国Sigma公司)用饱和苯甲酸水溶液定容于100mL容量瓶中。溶液可在室温下保存数月。2.2.2氨甲基3.4ml称取945mgNaBH4(贮存在干燥器中),加入2.25mL12mol/L氨水、6.75mL水。先加氨水,后加水。用前配制且最多只测大约90个样品。2.2.3d-糖糖组d-galactL-鼠李糖(L-rhamnose),2.5mg/mL;L-阿拉伯糖(L-arabinose),5.0mg/mL;D-木糖(D-xylose),5.0mg/mL;D-甘露糖(D-mannose),2.5mg/mL;D-半乳糖(D-galactose),5.0mg/mL;D-葡萄糖(D-glucose),2.5mg/mL。所有的标准糖(AR级,美国Sigma公司)用饱和苯甲酸水溶液定容于50mL的棕色容量瓶中。2.3色谱分析催化作用50mL具盖离心管(抗丙酮耐高温的离心管)和10mL具盖的塑料管;美国Agilent6890火焰检测器的气相色谱;细孔毛细管柱(CP-sil88,100m×250μm×0.20μm);无水乙醇、NaBH4、冰乙酸、乙酸酐、氢氧化钾、乙酸乙酯、氨水均为分析纯;标准单糖:木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、鼠李糖与阿洛糖均为美国Sigma试剂;1-甲基咪唑为英国Lancaster试剂;实验用水为超纯水。2.4糖液的校准曲线样品的预处理包括潮湿样品的混匀、冻干,试样粉碎过0.5mm的筛,并测定其干物质含量。取250mg样品置入50mL具盖离心管中,加入磁转子。在样品中加入5.0mL12mol/L的硫酸进行酸水解,旋涡混匀。在35℃放置1h,其间至少混匀两次。迅速加入25.0mL的水,旋涡混匀。在100℃沸水浴1h,中间磁力搅拌至少3次。用滤纸趁热过滤,收集酸水解液,移至加盖的塑料离心管中,-18℃存放。取出3mL酸水解液样品(糖的校准曲线的测定是3mL标准糖溶液,以下步骤与样品的测定相同),加入1mL内标阿洛糖,混匀。取出1mL置于离心管中,加入400μL12mol/L氨水,混匀,检测此时溶液应为碱性,否则加入过量的氨水。加入100μL硼氢化钠(NaBH4)溶液。旋涡混匀,在45℃水浴1h(样品可以摇,可起泡沫,而标样不能摇,不能有泡沫!)。加100μL冰乙酸,混匀,此时pH值应小于8,否则加过量的酸。取500μL混合液到50mL具盖离心管中,加500μL1-甲基咪唑和5mL乙酸酐。混匀,放置至温度降至35℃(约10min)。加1.0mL无水乙醇,混匀,冷水浴大约5min,下面的步骤均在冰上操作。加5mL水,混匀放置5min。迅速加5mL7.5mol/L氢氧化钾溶液,等所有的样品都凉了后混匀。然后再加入5mL7.5mol/L氢氧化钾溶液,加盖。放置至少10min至液体分层。将上层无色的糖醇乙酸酯层转入上机用小瓶中,注意勿吸下层水相。管中样品在上机前可在室温最多存放4d。2.5测定气相色谱的条件进样室的温度,260℃;柱温,210℃;检测器温度,260℃;流动相为氦气,总流量40mL/min。2.6回收率的测定回收率试验采取实际样品添加标样的方法测定,取3份平行样分别加入一定量的阿拉伯糖和木糖标准品,与该样品自身测定组同时同条件测定,测得阿拉伯糖和木糖的回收率。3结果与讨论3.1小麦可溶性nsp的组成标准糖溶液色谱图的出峰顺序依次为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、内标阿洛糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖,标准单糖的色谱图见图1,图谱显示各单糖分离效果较好。小麦可溶性NSP的化学组成见表1、图2和图3。本次实验所制备的2种可溶性NSP均为白色,其中主要单糖组成是阿拉伯糖和木糖,含有少量的葡萄糖、甘露糖和半乳糖。图谱显示各单糖分离效果较好。3.2回收率方法的回收率测得阿拉伯糖和木糖的回收率结果见表2。测定方法的回收率在95.56%—98.62%之间。3.3糖腈乙酰酯衍生法气相色谱法(GC)作为重要的仪器分析方法,因其独特的优势,在多糖的组成分析中得到了广泛使用。糖类物质不易汽化,在使用GC分析前需要预衍生化,使之成为易汽化的衍生物。因而衍生化的效果是影响GC分析结果的关键因素。目前经常采用的衍生方法有三甲基硅烷衍生法、糖腈乙酰酯衍生法和糖醇乙酰酯衍生法。由于硅烷化在生成糖肟三甲基硅醚衍生物时会产生衍生物的异构体,对D-甘露糖、D-葡萄糖和五碳糖D-核糖、D-阿拉伯糖情况较差,在色谱图上出现的峰会发生改变,给定性和定量带来困难。糖腈乙酰酯衍生法操作复杂,时间长,需要反复去除衍生试剂。衍生化目前普遍采用乙酰化的方法,先将糖还原为糖醇,再衍生为乙酸酯,这样单糖经糖醇乙酰化反应,生成易挥发的糖醇乙酸酯衍生物,可直接进行气相色谱分离。该法具有定性简单、可靠和定量准确的优点,不需要减压浓缩、萃取等繁琐过程。本试验所采取的方法较廖洪梅等(2008)的方法在还原和乙酰化的反应条件和反应时间都进行了简化,更易操作。不足之处在于所有GC分析方法只适合中性糖的测定,不适合糖醛酸和氨基糖的测定。有报道