胆红素下脚料中提取三种胆酸的工艺研究

胆红素下脚料中提取三种胆酸的工艺研究

胆汁酸是果汁的主要成分，约占果汁总数的50%70%。它主要由猪厌氧菌酸、猪厌氧菌酸、鹅厌氧菌酸、3'羟基-6-5'-氧磷酸和胆石酸组成。其中，约有40%的猪厌氧菌酸和约25%的鹅厌氧菌酸。目前,猪胆汁的利用主要是提取猪去氧胆酸或鹅去氧胆酸,但很少有工艺能一次性将猪胆汁中的几个成分分离。在提取猪去氧胆酸时主要采用大量乙酸乙酯进行提取和纯化,所得产品纯度低。也有对乙酸乙酯提取物采用丙酮重结晶法,甲醇(或乙醇)-水重结晶法等,但需要使用大量有机溶剂,而且生产周期长,不能大规模生产。鹅去氧胆酸的提取主要采用钡盐沉淀法,结晶提取法、离子交换树脂法,这些方法提取收率低,纯度仅90%左右。本研究参考文献,先将猪总胆汁酸甲酯化,得到混合胆酸甲酯,加入苯或甲苯以加合物的形式分离出猪去氧胆酸甲酯;剩下的成分用乙酸酐将胆酸甲酯中含有的羟基全部乙酰化,再根据它们在正己烷或石油醚中的溶解性差异加以分离,得到猪胆酸甲酯三乙酸酯,最后再用乙醇将鹅去氧胆酸甲酯二乙酸酯结晶析出。这样不仅得到猪去氧胆酸甲酯,还有猪胆酸甲酯三乙酸酯及鹅去氧胆酸甲酯二乙酸酯,再分别进行水解即得到猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸和猪胆酸。该法不仅高效地得到了高纯度的猪去氧胆酸,还得到了高纯度的猪胆酸和鹅去氧胆酸,提高了猪胆汁的综合利用效率。1蒸发光散射检测仪器混合猪胆汁酸为四川弘茂制药有限公司皂化后粗品。所用试剂和溶剂均为分析纯。Yanaco显微熔点仪(温度未经校正);AllTechhplc426,AlltechELSD2000蒸发光散射检测器;VarianINOVA400高分辨率核磁共振波谱仪(溶剂DMSO-d6,TMS作内标);A12630APIV/6W自动旋光仪;FinniganLCQDECA型质谱仪。2方法2.1猪去氧胆酸甲酯-苯加合物的合成在1L烧瓶中加入混合胆汁酸粗品100g,甲醇500mL,搅拌溶解后,缓慢滴加硫酸7mL,并于室温下搅拌24h,薄层色谱(TLC)监测反应完毕。以无水NaHCO3固体调pH至中性,过滤掉无机盐,滤饼用甲醇洗涤,合并滤液及洗液,减压回收甲醇,得棕褐色黏稠状物,加水100mL溶解其中的无机盐,再以乙醚提取有机物,合并有机相,分别以饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水洗涤,无水Na2SO4干燥,过滤,减压除去乙醚,得棕色黏稠物105g。向烧瓶中加入苯300mL,于80℃加热溶解后自然冷却至室温,析出固体,过滤,滤饼以苯洗涤2～3次,得到类白色固体58g,再用苯重结晶,干燥后得白色固体52g,经TLC检测为单一斑点,展开剂为乙酸乙酯-石油醚(3∶1),Rf值为0.49;mp(熔点)87～88℃,即猪去氧胆酸甲酯-苯加合物,收率41%。在100mL烧瓶中加入猪去氧胆酸甲酯-苯加合物50g,NaOH5g,乙醇100mL和水10mL,于80℃搅拌回流反应5h,TLC监测反应完毕后,减压回收溶剂至干,得淡黄色固体,加水150mL,搅拌下用10%盐酸溶液调pH至1～2,析出固体,继续在常温下搅拌0.5h,过滤,滤饼用水洗涤至中性,于50℃真空干燥6～8h,得到淡黄色固体37.2g,纯度为95.6%。以乙酸乙酯重结晶,得猪去氧胆酸35.4g,mp201～202℃,纯度99.1%,总收率36.8%,气相色谱(GC)分析未检测出苯。1HNMR:δ11.96(s,1H,24-COOH),4.42(d,J=4.4Hz,1H,3-OH),4.21(d,J=4.0Hz,6-OH),3.82(m,1H,6-CH),3.29(m,1H,3-CH),2.25(m,1H,23-CH),2.08(m,1H,23-CH),1.92(m,1H,12-CH),1.86～1.72(m,2H,2-CH,4-CH),1.72～1.76(m,2H,1-CH,22-CH),1.22～1.58(m,9H),0.87～1.22(m,10H),0.86(d,J=6.4Hz,3H,21-CH3),0.84(s,3H,19-CH3),0.60(s,3H,18-CH3).[α]20DD20=+8.2°(c=1,甲醇);MS:393.3113(M+H+,理论值393.2999)。2.2猪胆酸甲酯三醋酸酯的合成将2.1项下的滤液、洗液以及重结晶母液合并,减压回收苯至尽,得到棕色黏稠状物65g。加入乙酸酐150mL,乙酸钠15g,于110℃回流5h,TLC监测反应完成后,减压蒸除约2/3体积的乙酸酐,待降至室温后加水50mL以溶解其中的无机盐,用乙醚分次提取有机物,合并有机相,先用1%NaOH溶液洗涤有机相至接近中性,再用饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水洗涤,无水Na2SO4干燥,过滤,回收乙醚,得棕黑色黏稠状物76g。向烧瓶中加入正己烷250mL,体系升温至65℃搅拌使其完全溶解后停止加热,自然降至室温,在室温下搅拌2h,过滤,滤饼用正己烷洗涤3次,干燥后得到棕色粉末17g,依次以甲醇及苯-石油醚重结晶,得白色粉末8.2g,mp184～186℃(文献值181～183℃),为猪胆酸甲酯三醋酸酯。取250mL圆底烧瓶,依次加入猪胆酸甲酯三醋酸酯8g(14.6mmol),NaOH5g(125mmol),乙醇50mL,水5mL,于80℃回流反应6h,TLC监测反应完毕后,减压回收溶剂,得灰白色固体,加水10mL,剧烈搅拌下用10%盐酸调节而至pH1～2,过滤,滤饼用5%盐酸洗涤一次,再用水洗涤至中性,干燥后得到浅黄色固体5.5g。用乙酸乙酯重结晶,干燥至恒重,得白色粉末5.1g,TLC检测为单一斑点,展开剂为乙酸乙酯-石油醚-乙酸(5∶5∶1),Rf值为0.28;mp185～186℃(文献值183～184℃],即为猪胆酸,总收率为5.1%。1HNMR:δ11.96(s,1H,COOH),4.33(d,J=4.4Hz,1H,3-OH),4.20(d,J=5.6Hz,1H,6-OH),3.90(s,1H,7-OH),3.57(brs,2H,6-CH,7-CH),3.11(brs,1H,3-CH),2.08～2.33(m,2H,23-CH3),1.80～1.92(m,1H,12-CH),1.56～1.72(m,7H),0.96～1.50(m,14H),0.88(d,J=6.4Hz,21-CH3),0.83(s,3H,19-CH3),0.60(s,3H,18-CH3)。MS:409.2985(M+H+,理论值为409.2949),431.2817(M+Na+,理论值431.2768)。[α]20DD20=+4.8°(c=1.7,甲醇),CombinedChemicalDictionary(CCD)中[α]21DD21=+5.5°(c=1.7,甲醇)。2.3普遍测量法提取单一点点将提取完猪胆酸甲酯三醋酸酯的母液与重结晶母液合并,回收溶剂,得到棕褐色黏稠状物56g,此时其主要成分为鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯。加入乙醇100mL,升温至65℃待黏稠物全部溶解后停止加热,体系自然降至室温后于冰箱中静置72h,析出黄色固体,过滤,滤饼用冰冷甲醇洗涤,干燥后得淡黄色粉末23g。用甲醇重结晶,得白色粉末18.6g,TLC检测为单一斑点,展开剂为乙酸乙酯-石油醚(3∶1),Rf=0.56;mp115～116℃(文献值112～113℃),为鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯。取250mL圆底烧瓶,依次加入鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯18g(36.7mmol),NaOH5g(125mmol),乙醇100mL,水10mL,于80℃回流5h,TLC监测反应完毕后,减压回收溶剂,得灰白色固体,加水20mL,剧烈搅拌下用10%盐酸溶液调pH至1～2,析出固体,继续于常温下搅拌0.5h,过滤,滤饼依次用5%盐酸和水洗涤,减压干燥后得到白色固体13.1g。用丙酮-水重结晶,干燥至恒重后得白色粉末12.6g,TLC检测为单一斑点,展开剂为乙酸乙酯-石油醚-乙酸(5∶5∶1),Rf=0.41;mp144～146℃(文献值143～144℃),总收率15%。[α]20DD20=+10.2°(c=1,甲醇)[CCD中[α]21DD21=+11°(乙醇)]。1HNMR:δ11.97(s,1H,24-COOH),4.33(d,J=4.4Hz,1H,3-OH),4.13(d,J=3.2Hz,7-OH),3.62(m,1H,7-CH),3.18(m,1H,3-CH),2.23～2.18(m,1H,23-CH),2.12～2.10(m,1H,23-CH),1.91(m,1H,12-CH),1.82～1.66(m,6H),1.48～1.35(m,6H),1.27～1.14(m,7H),1.11～1.06(m,4H),0.86(d,J=6.8Hz,3H,21-CH3),0.84(s,3H,19-CH3),0.60(s,3H,18-CH3)。3结果与讨论3.1酯化反应条件甲酯化反应中酸催化剂的使用对实验结果影响较大。因此选择对甲苯磺酸、磷酸和硫酸对酯化反应进行了考察,反应条件为常温下搅拌24h。发现三种酸均可催化该反应,但硫酸在常温下即可较好的催化该反应,当投料比为1∶0.5时,室温24h即可完成反应,因此,选用硫酸作为酸催化剂,确定原料与硫酸的投料比为1∶0.5。3.2提取溶剂的选择由于用乙酸酐酯化后的产物为棕色黏稠物,不易分离,要选取一个适宜的提取溶剂来提取猪胆酸酯。取同批次的棕色黏稠物各5g,考察了正戊烷,正己烷以及石油醚的提取效果。结果发现正己烷作为提取溶剂时收率最高,因此本研究选取正己烷作为提取猪胆酸酯的溶剂。3.3重结晶试剂的选择由正己烷提取出的猪胆酸甲酯三醋酸酯干燥后为淡棕色固体,用甲醇重结晶后得到类白色固体,再用溶剂进行二次重结晶,考察了苯、苯-石油醚作为重结晶溶剂对产品收率的影响,发现单独使用苯作为重结晶溶剂时,收率仅为52%,而使用苯-石油醚重结晶时收率达到86.2%,而且得到的产品纯度经高效液相色谱(HPLC)分析,含量大于98%,因此选用苯-石油醚作为此步的重结晶试剂。3.4提取溶剂的确定得到除去溶剂后的棕褐色黏稠物后,取等量的棕色黏稠物各5g,考察了甲醇和乙醇作为鹅去氧胆酸酯的提取溶剂,以及提取时间对产品的影响,结果发现,乙醇对鹅去氧胆酸甲酯二醋酸