五苓散对腹泻模型大鼠结肠aqp4及aqp4mrna表达的影响

五苓散对腹泻模型大鼠结肠aqp4及aqp4mrna表达的影响

中医认为，腹泻是由水和除湿引起的。武陵散通过“益小便、病轻大便”达到排便目的。研究认为,结肠功能失调对水的重吸收功能下降是产生腹泻的原因之一。结肠对水的吸收作用与水通道蛋白(AQPs)表达密切相关。本实验通过观察五苓散等对腹泻模型大鼠结肠AQP4和AQP4mRNA表达的影响,揭示五苓散治疗腹泻的作用机理。1材料表面1.1实验动物资源SPF级SD大鼠216只,雌雄各半,2月龄,体重160g±20g,由北京中国药品生物制品检定所实验动物资源中心提供(许可证号SCXK(京)2005-0004)。1.2aqp4试验方法五苓散购于同仁堂药店,按《中国药典》和《伤寒论》配制:猪苓150g,泽泻250g,白术150g,茯苓150g,桂枝100g,共研细粉过120目筛,干燥备用。实验前加蒸馏水配成相应浓度。氢氯噻嗪:山西云鹏制药股份有限公司生产(批号A090802)。实验前加蒸馏水配成相应浓度。口服盐液(ORS):按世界卫生组织(WHO)推荐配方配制。葡萄糖20g,氯化钠3.5g,碳酸氢钠2.5,氯化钾1.5g,加蒸馏水至1000ml。番泻叶液制备:200g番泻叶浸入100℃1000ml纯净水,充分搅拌30min后用纱布绞出滤液600ml备用;大鼠AQP4(H-80)抗体:由美国SantaCruz公司提供;大鼠AQP4原位杂交试剂盒:由武汉博士德生物工程有限公司提供。本试剂盒采用针对AQP4的寡核苷酸探针,经地高辛高效标记,其针对大鼠AQP4靶基因的mRNA序列为:5’-GACTCCTGTTGTCCTCCACCTCCATGTAGCTCCCTTTTTGTT-3’。超敏即用型二步法(非生物素)检测试剂盒:由北京中杉金桥生物技术有限公司提供;DAB显色试剂盒:由福州迈新生物技术开发有限公司公司提供。1.3ctr4000显微及图像分析系统冷冻切片机:英国SHONDON公司产品;AS325型切片机:英国SHONDON公司产品;LEICACTR6000显微镜及LeicaQwinV3图像分析系统:德国Leica公司;恒温恒湿箱:上海博迅实业有限公司医疗设备厂。2方法2.1茯苓散全剂量的确定动物随机分为7组:(1)正常对照组;(2)腹泻模型组;(3)口服盐液组:自由饮用口服盐液(ORC);(4)氢氯噻嗪组:灌胃氢氯噻嗪9mg/kg(相当于成人剂量100mg/d等效剂量);(5)五苓散低剂量组:灌胃五苓散1.35g/kg(相当于成人剂量15g/d等效剂量);(6)五苓散中剂量组:灌胃五苓散2.7g/kg;(7)五苓散高剂量组:五苓散5.4g/kg。(2)~(7)组连续6d每日上午灌胃20ml/kg番泻叶液制作并维持模型腹泻状态,(4)~(7)组每日下午灌胃给药1次。所有大鼠实验前和给药后每天下午称体重,观察大鼠的一般状态、粪便状态,稀便率等。第4天上午、第7天上午分2批宰杀动物,取大鼠结肠和测AQP4表达、AQP4mRNA表达。2.2aqp4和aqp4mnma的检测2.2.1马立克氏体酶活性测定冰冻切片置室温下晾干,0.01MPBS冲洗3minx2次;0.3%过氧化氢甲醇(甲醇80ml+0.01MPBS100ml+30%过氧化氢1.8ml)室温处理20min,以消除内源性过氧化物酶的影响;0.01MPBS清洗3min×3;加入用血清稀释液(牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS100ml)稀释的一抗(1∶800),室温放置1h,以0.01MPBS代替一抗作为阴性对照。吸去抗体,0.01MPBS洗3min×3;滴加试剂1,室温孵育10min,0.01MPBS洗3min×3;滴加试剂2,室温孵育10min,0.01MPBS洗3min×5;DAB显色:使用DAB显色试剂液,混匀后加至切片。室温显色,镜下控制反应时间,反应时间为40s左右。蒸馏水终止、洗涤;苏木素复染,充分水洗、脱水、透明、封片,显微镜观察。结果判断阳性反应细胞胞浆着色呈棕黄色。2.2.2mna核酸染色玻片和玻璃容器的处理:载玻片和玻璃容器先用洗涤剂浸泡,洗净后泡酸过夜,用自来水冲洗,蒸馏水洗5次,置180℃烤箱中干烤6h。然后将多聚赖氨酸与蒸馏水1∶10的比例配成溶液,将其涂布于玻片上,待干燥后即可使用。DEPC水的配制:用蒸馏水配制,DEPC的终浓度为1‰,用力振荡、摇匀,过夜后完全溶解。然后高压15min,自然冷却备用。冰冻切片置室温下晾干;用原位杂交用PBS(含1‰DEPC,高温高压处理)冲洗3min×3次;3%H2O2室温下10min以灭活内源性酶。蒸馏水洗涤3min×3次;暴露mRNA核酸片断,切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶,37℃消化5min。原位杂交用PBS洗5min×3次,蒸馏水洗1次后固定。固定液为1%多聚甲醛/0.1MPBS(pH7.3),含有1‰DEPC。室温固定10min,蒸馏水洗涤3次;预杂交:湿盒的准备,在干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μl加预杂交液。恒温箱41℃4h。吸取多余液体,不洗;杂交:按每张切片20μl杂交液(另以0.01MPBS代替杂交液作为阴性对照),加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱41℃杂交过夜;杂交后洗涤:揭掉盖玻片后,37℃左右水温2×SSC洗涤5min×2次;37℃0.5×SSC洗涤15min×1次;37℃0.2×SSC洗涤15min×1次;滴加封闭液,37℃30min。甩去多余液体,不洗;滴加生物素化鼠抗地高辛,37℃60min。原位杂交用PBS洗5min×4次;滴加SABC,37℃20min。原位杂交用PBS洗5min×3次;滴加生物素化过氧化物酶:37℃20min或室温30min。原位杂交用PBS洗5min×4次;DAB显色:使用DAB显色试剂盒。取1ml蒸馏水,加试剂盒中A、B、C试剂各1滴混匀,加至标本上。室温显色,镜下控制反应时间,一般在1min左右。蒸馏水洗涤,苏木素复染,充分水洗;脱水、透明、封片,显微镜下观察。结果判断:阳性反应细胞胞浆着色呈棕黄色。2.2.3平均光密度测定用Leica-Qwin图像分析系统进行检测。在10×10放大倍数和相同光强度下,每张切片随机取2个视野(已摄入结肠大部分),分别测定每个视野相同面积测量框内AQP4阳性产物的平均光密度值,平均光密度值越大,表示AQP4含量越多。2.3统计方法各组数据以均数±标准差表示,采用SPSS统计软件分析数据,组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。3各组大鼠aqp4mrna表达比较(2)~(7)组灌胃番泻叶后全部出现腹泻,排不成形含大量水和黏液的稀便,稀便率为100%。同时大鼠出现不同程度的精神萎靡、皮毛色泽下降、肛门周围污浊等。正常对照组体重继续增长。在持续灌胃番泻叶6d过程中,口服盐液组体重增长变慢,其余各组体重停止增长或下降。五苓散高剂量组3d后大便已经成形,黏液较少,但与对照组比大便仍较湿软。各组大鼠AQP4及AQP4mRNA表达见表1、表2。表2显示,腹泻模型组、口服盐液组、五苓散低剂量组实验3d和6d后结肠AQP4表达、AQP4mRNA表达明显下调,与正常组比较有显著差异(P<0.01);氢氯噻嗪组下调不明显,仅6d后AQP4表达低于正常组(P<0.05),AQP4及AQP4mRNA表达明显高于模型组(P<0.05或P<0.01);五苓散中剂量组结肠AQP4表达下调,3d和6d后检测均低于正常组(P<0.05),但高于腹泻模型组(P<0.05),AQP4mRNA表达6d后下调不明显,明显高于模型组(P<0.01);高剂量组结肠AQP4及AQP4mRNA表达3d后与6d后检测下调都不明显,与正常组比没有明显差异,明显高于模型组(P<0.01)。4药养对腹泻大鼠结肠aqp4mrna表达的影响肠道为水液转运活跃的部位,每天有大约9L的水液在消化道分泌和吸收。以前认为水在肠道的转运取决于电解质转运产生的肠腔内外渗透压的差别,现在认为结肠对水的重吸收是逆渗透梯度的主动吸收过程,主要依靠水通道蛋白(AQPs)的转运功能来完成。水通道蛋白是存在于动植物细胞膜上转运水的特异性通道,目前已经发现13种水通道蛋白,其中AQP4在脑、肾、气管、支气管、肌肉、视网膜、肝、胰、胃、小肠、结肠等许多组织有表达,参与这些组织的生理、病理过程。近期较多的研究表明,AQP4在脑水肿形成过程起重要作用。AQP4在结肠主要表达于近端结肠的吸收细胞,剔除AQP4基因的小鼠其结肠对水分的吸收功能下降,粪便中水分明显增多,说明AQP4对肠道内水的重吸收具有重要意义,AQP4表达下调是腹泻的病理基础。番泻叶能使肠蠕动增加,肠道对水等物质的消化吸收受抑制,并刺激肠道引起炎症介质合成和释放,使黏膜受损和促进大肠排空,造成大鼠腹泻。本实验显示,腹泻模型组大鼠结肠AQP4表达下调,同时结肠AQP4转录和翻译水平即AQP4mRNA表达下调,使结肠对水的重吸收减少,大便含水量增加,是腹泻形成的分子学基础。口服盐液组大鼠结肠AQP4及AQP4mRNA表达下调,说明口服盐液可能对结肠水吸收功能没有明显促进作用。五苓散高剂量组能上调腹泻模型大鼠结肠AQP4及AQP4mRNA表达,这可能是五苓散止泻