流感嗜血杆菌的实验活动生物危害评估报告

流感嗜血杆菌的生物危害评估报告一、细菌的传播与致病嗜血杆菌是只有在含有血或血制品及其因子的营养条件下才能生长发育的一群细菌。目前发现的嗜血杆菌有16种，可致人类疾病的至少有8种，其中最具代表性的为Ｈｉ。根据荚膜成分的不同，Ｈｉ又分为ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ6种菌型，其中又以ｂ型流感嗜血杆菌（Ｈｉｂ）最容易引起侵袭性疾病。流感嗜血杆菌主要寄生于人的鼻、咽、眼及阴道黏膜中，常与正常菌群共生，人是唯一的传染源和带菌者，病人和鼻咽带菌者为传染源。健康人鼻咽部带菌率可高达60～80％。带菌可持续数日或数月。Ｈｉｂ多寄居在鼻咽部黏膜，通过空气飞沫和密切接触在人与人之间传播，新生儿可通过母亲的产道感染。流感嗜血杆菌只引起人类感染，对动物无致病性。同样，寄居于禽类、猪、犬的嗜血杆菌也不感染人类。有研究表明，人群对流感嗜血杆菌普遍易感。新生儿由母体抗体被动免疫，3个月～3岁儿童的抗体水平最低，对该菌最易感，Ｈｉ在健康学龄前儿童的带菌率为10.9％～37.9％，学龄儿童最高可达20.9％；Ｈｉｂ在学龄前儿童带菌率为5.4％～6.9％。成人可为无症状带菌者，其发病多有免疫缺陷。Ｈｉ带菌率与季节有关，感染多散发，一年四季皆可发病，但多从秋季开始增加，冬季达高峰。Ｈｉｂ通过飞沫进入人的呼吸道，侵入血液繁殖，可扩散至人体多个器官，引起组织、器官的侵袭性感染。流感嗜血杆菌是幼儿脑膜炎,菌血症,脓毒性关节炎,肺炎,气管支气管炎,中耳炎,结膜炎,鼻窦炎和急性会厌炎的主要病原菌，这些感染和心内膜炎也可发生于成人但比较少见。国内的临床调查显示，儿童社区获得性肺炎中，Ｈｉ占29.0％。Ｈｉ所致的感染以呼吸道感染居多，其中肺炎多通过飞沫传播。流感病毒或葡萄球菌感染的患者易并发Ｈｉ肺炎，起病较慢，常有痉挛性咳嗽，全身症状重，中毒症状明显，白细胞明显增高，有时伴淋巴细胞的相对或绝对升高。小婴儿Ｈｉｂ肺炎常并发脓胸、脑膜炎及化脓性关节炎，易后遗支气管扩张症。Ｈｉｂ脑膜炎在儿童化脓性脑膜炎中占28.9％～51.7％。在欧美国家，Ｈｉｂ是儿童未使用疫苗前化脓性脑膜炎中居首位的病原菌。化脓性脑膜炎较常见，但危害大，其发病率仅次于流脑。多数患者具有明显的前驱症状，常见流涕、咳嗽等，经数日或1～2周方出现脑膜刺激征，以冬春两季多发。10％的儿童有单侧或双侧性耳聋。其他并发症如学习能力差、精神发育迟缓、颅神经麻痹、瘫痪等通常为暂时性的，有望治愈。Ｈｉｂ感染常致会厌炎，表现为会厌部红肿、吞咽不适，有时发生呼吸困难。在中国发病率较低，但病死率可高达7％～8％。化脓性中耳炎等在国内相对少见。二、细菌的生物学特性流感嗜血杆菌（Hemophilusinfluenzae，Ｈｉ）简称流感杆菌，又名费佛氏杆菌（Pfeiffer'sbacillus），为革兰氏阴性短小杆菌，大小为0.8～1.5ｍｍ×0.3～0.4ｍｍ，两端钝圆。从病灶中新分离的菌株多呈球杆状或双球状，有时可呈短链。在陈旧培养物中呈多形性，有长杆状或丝状体。本菌无动力、无芽孢，粘液型菌株有荚膜。Ｈｉｂ为需氧菌，培养较困难，由于该菌氧化还原酶系统不完善，生长时需要“Ｘ”和“Ｖ”两种生长辅助因子。“Ｘ”因子存在于血红蛋白中，可耐高温。“Ｖ”因子存在血液中，耐热性较差。在血液中“Ｖ”因子处于被抑制状态，加热75～100℃，5～10min，抑制物被破坏后才被18～24小时，菌落微小，无色，透明似露珠，48小时后形成灰白色较大的菌落、圆形、透明。如以Ｈｉｂ和金黄色葡萄球菌在同一巧克力琼脂平皿上培养，由于葡萄球菌能合成较多的“Ｖ”因子，并弥散到培养基里，可促进Ｈｉｂ的生长，故在葡萄球菌菌落周围生长的Ｈｉｂ的菌落较大，距离葡萄球菌菌落越远的Ｈｉｂ的菌落越小。此称为“卫星现象”。这一特点有助于对此菌的鉴定。由于有些标本如痰，有大量杂菌生长，对Ｈｉｂ的分离培养影响较大，在巧克力琼脂平皿内加入该菌可耐受的抗生素（每毫升巧克力琼脂内加万古霉素50ｍｇ，杆菌肽30ｍｇ，氯林可霉素1ｍｇ）可提高本菌的分离率。根据荚膜多糖抗原成分的不同，应用型特异性免疫血清作荚膜肿胀试验或其它血清学试验，可以将Ｈｉｂ分成6个（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ）血清型。其中ｂ型对婴幼儿的致病性最强，且最多见，ｆ型次之。三、细菌的实验室检查及其它检查虽然有些病例可根据病史和临床表现疑为流感嗜血杆菌感染，但必须通过实验检查方可确诊。1.血常规此杆菌感染时病人血液白细胞大多增高，通常为15×109/L～30×10９/L，重症患者的白细胞总数可减少。2.细菌培养可采取病人脑脊液、血液和穿刺抽取液进行细菌培养予以确诊。3.采用对流免疫电泳，胶乳凝集，协同凝集和ELISA等方法检查脑脊液、血液和浓缩的尿液中Ｈｉｂ的特异抗原磷酸聚核糖基核糖醇（Polyribosylribitolphosphate，PRP），均可辅助临床诊断。四、细菌的防治由于人群对流感嗜血杆菌普遍易感，特别是２个月至２岁的婴幼儿，一家中同时有两个小儿患病者，在文献中屡有报道，所以在兄弟姐妹或在托儿机构中出现首例病人后有时亦可再出现新病例，对病人密切接触者可采取化学药物预防，口服利福平可清除带菌，20ｍｇ/Kg，每日一次，服４日为一疗程。每日最大剂量为600ｍg～900ｍg，孕妇不宜用。对Ｈｉｂ感染最有效的预防措施是肌肉注射Ｈｉｂ偶联菌苗。芬兰赫尔辛基于70年代后期在0～4岁儿童中Ｈｉｂ脑膜炎的发病率为43／10万。注射上述菌苗后到1991年发病率降为0。Ｈｉｂ的特异抗原磷酸聚核糖基核糖醇（PRP）可与４种蛋白载体（变异性白喉杆菌蛋白－Oligosaccharide－CRM197protein，HbOC、白喉杆菌类毒素－Diphtheriatoxoids，D、脑膜炎双球菌外膜蛋白复合物－Outermembraneproteincompound，OMPC和破伤风杆菌类毒素－Tetanustoxoid，T）偶联，分别构成４种类型的偶联菌苗：PRP-HbOC、PRP-D、PRP-OMPC和PRP-T。目前至少有２５个国家将Ｈｉｂ偶联菌苗列入儿童的免疫计划。具体的接种方法为：婴儿从２月龄开始接种，每间隔１～２个月１次，共３次；６～１２月龄的婴儿需注射２次，每次间隔１～２个月；１～５岁的儿童只需注射１次。鉴于Ｈｉｂ肺炎、脑膜炎在低龄组发病率更高，症状及并发症更严重，故应及早接种疫苗。接种Ｈｉｂ疫苗后，极少数儿童的接种部位会出现轻微红肿、疼痛或低热，一般２～３天内消失，只需休息或对症处理。婴幼儿在患急性发热性疾病或严重慢性疾病发病时，均应暂缓接种。对破伤风类毒素过敏者或曾对Ｈｉｂ疫苗过敏者应避免接种。此外预防Ｈｉｂ感染的最重要方法是对５岁以下儿童进行大面积免疫接种；对2月龄婴儿进行常规接种并提倡母乳喂养；减少与无症状携带者或有侵袭性疾病患者的密切接触；规范抗生素使用；改善居住环境卫生等。在对病患进行治疗时，由于目前国内普遍存在滥用抗生素和不规律使用抗生素现象，因此Ｈｉ对抗生素的耐药率逐年上升。所以抗生素的选择一定要根据感染部位而定,如脑膜炎和会厌炎.Hib型嗜血流感杆菌结合的疫苗可用于≥2个月的儿童,能有效地预防侵袭性感染如脑膜炎,会厌炎和菌血症等。对体重在20kg以下儿童可每天按100mg/kg静脉注射氨苄青霉素,20kg以上儿童和成年人用量为250mg~1g,每6小时1次。另一种办法是口服羟氨苄青霉素,20kg以下儿童20~40mg/kg,每日3次；20kg以上儿童和成年人250~500mg,每日3次；约30%的流感嗜血杆菌产生β-内酰胺酶且对氨苄西林耐药。因此,常用的治疗方案为：磺胺甲基异啰唑/甲氧苄氨嘧啶(SMX/TMP)儿童每日8mg/40mg/kg,口服或静脉注射,成人则为口服1~2片(每片为160mg/800mg),每日2次；头孢呋辛0.25~1g静脉注射,每6小时1次；头孢克罗儿童每日20~40mg/kg,分3次口服,成人500mg口服,每6小时1次；或强力霉素100mg口服,每日2次(8岁以下儿童忌用).对非耐药菌株,在小于20kg儿童可予氨苄青霉素每日100mg/kg,分4次静脉注射(最大剂量为每日2~3g),在大于20kg儿童及成人则为250mg~1g,每6小时1次静脉注射.尚可使用阿莫西林,对小于20kg儿童,可予20~40mg/kg口服,每日3次；对大于20kg儿童及成人,可予250~500mg,每日3次。氟喹诺酮和阿奇霉素对流感嗜血杆菌亦有抗菌活性。五、细菌的生物安全防护根据《病原微生物生物实验室生物安全管理条例》中的有关规定，人间传播的微生物名录（待颁布）流感嗜血杆菌属于三类，BSL-2。相关的防护事宜包括：（1）操作要求1、实验时，未经实验室主任同意，限制或禁止进入实验室。2、所有的操作过程应尽量细心，避免产生和溅出气溶胶。3、对于污染的锐器，必须时刻保持高度的警惕，包括针、注射器、玻片、加样器等。4、打碎的器皿不能直接用手处理，必须用其它工具处理，如刷子和簸箕、夹子或镊子。盛污染的针头、锐器、碎玻璃的容器在倒掉前，应按照相关的规定进行消毒。5、所有的培养物、储存物及其它规定的废物在释放前，均应使用可行的消毒方法进行消毒，如高压灭菌。转移到就近实验室消毒的物料应置于耐用、防漏容器内，密封运出实验室。离开该系统进行消毒的物料，在转移前应包装，其包装应符合有关的法规。6、溅出或偶然事件中，明显暴露于传染源时，要立即向实验室主任报告。进行适当的医学评估、观察、治疗，保留书面记录。7、按日常程序、在有关传染源的工作结束后、尤其是传染源溅出或洒出后、或受到其他传染源污染后，实验室设备和工作台面应当使用有效的消毒剂消毒。污染的设备在送去修理、维护前，要按照相关的规定消毒；在离开设施转移前，要按照相关的规定打包运输。（2）安全设备1、正确使用和保养生物安全柜、最好是二级生物安全柜、或其他合适的人员防护设施、或物理遏制装置。2、确定可能形成传染性气溶胶或溅出物的实验过程，如开启装有传染源的容器、采集感染标本等。3、涉及高浓度或大体积的传染源时，若选用密封转头或带安全罩的离心机，若转头或安全罩仅在生物安全柜中打开，则可在开放实验室内离心。4、当必须在生物安全柜外处理标本时，需采取面部保护措施（跟镜、口罩、面罩、或其他防溅装置），以