原位多聚酶链反应insiu的研究进展

原位多聚酶链反应insiu的研究进展

20世纪90年代，哈希首次报告了致死多聚酶链反应（insitupcr）。该技术结合了传统PCR的高效扩增和原位杂交的细胞定位的优点。传统PCR技术自Mullis等人发明以来,对分子生物学产生了深刻的影响,它提供了一种相当有效的方法用于扩增微量DNA或RNA至几百万倍用于测序、克隆和诊断等。但它不能反映扩增产物和组织结构之间的关系。原位杂交技术自Gall和Pardue首次报道以来,经历了许多变化,目前在动植物及人类研究中发展很快。它能够检测细胞组织样品中的DNA和RNA,从而揭示DNA或RNA序列与组织结构之间的关系,但它需要相当大量的DNA和RNA用于检测,低拷贝的DNA和RNA不能检测到。因此,它在许多研究领域里受到限制。原位PCR成功地结合了PCR技术和原位杂交技术的优点,能够在组织切片、细胞等样品中检测到低拷贝至单个拷贝的DNA或RNA,并在细胞形态学上准确定位。通过揭示细胞内低拷贝核酸的分布,可进一步进行病毒感染、基因突变、染色体易位、基因低水平表达和基因治疗等研究。本文将介绍原位PCR的主要研究方案、基本步骤及其应用。1利用细胞进行原位检测自从液相PCR发明以来,就有人试图进行原位PCR。1990年,Hasse等首次报道了一个成功的原位PCR试验。他们在混浊液中固定完整的细胞,通过酶消化来预处理核膜,从而允许引物、聚合酶、游离核苷酸进入核膜内,通过带有互补末端的多重引物来设法扩大要扩增信号的大小,利用细胞膜作为一个袋子保存扩增产物扩增是在反应管中进行,其原理与液相PCR的扩增原理基本相同。反应结束后,将细胞离心沉淀在载玻片上,再对扩增产物进行原位检测。自那以后,许多实验室相继报道成功地进行过原位PCR。其基本原理与原方案相符,但大多对原型作了不同程度的改进。研究对象从完整细胞悬液发展为细胞涂片、细胞离心标本、冰冻切片和石蜡切片、中期染色体标本等。研究方案亦在不断改进,总体上有以下几种。1.1pcr扩增结果不同直接原位PCR是使用标记的引物或游离核苷酸进行原位PCR反应,这种标记分子随后进入扩增产物中,扩增结果可直接观察而不需要进行原位杂交(图1)。直接原位PCR具有操作简便、流程短、省时的优点,现已有不少成功的报道。但直接原位PCR易发生引物错配或非特异性退火,容易出现假阳性;此外,标记的引物还会降低PCR效率。因而它尚需进一步改进,才能成为更加可靠的方法。1.2原位杂交再检测间接原位PCR是在没有标记物的情况下进行PCR反应,扩增反应结束后,再用原位杂交技术来检测扩增的信号(图1)。该方法可以克服由于DNA修复或引物错配引起的非特异性问题,成为目前最广泛使用的方案。该方法需要进行扩增反应后的洗脱和原位杂交过程,因而所需时间相对较长。1.3rewelltranscrapt-pcr检测mrna表达在原位PCR中加上一步反转录过程(RT),新形成的cDNA作为模板用于扩增,这个过程叫做原位反转录PCR(insitureversetranscriptionPCR,简称原位RT-PCR)。它又分为直接原位RT-PCR和间接原位RT-PCR两种(图2)。该方法可用来检测细胞或组织中低拷贝的mRNA或特异基因的表达在原位中首先要对组织样品进行DNA酶处理,以破坏组织细胞中的DNA。1991年,Cetus公司推出了一种新酶,可以同时执行RT和PCR反应,从而减少了反应时间。1.4进行3r反应Zebe等1994年率先提出了原位再生式复制反应(Self-sustainedsequencereplicationreaction,简称3SR反应)。它可作为原位RT-PCR的一种选择方法用于完整的细胞和组织切片中低拷贝数mRNA的检测。它还特别有利于与免疫组织化学相结合。2原pcr的主要步骤原位PCR整个过程相当复杂,而且技术要求高。这项技术还在它的完善阶段正经历许多发展它的成功取决于适当操作和被证实的特异对照。下2.1原位pcr固定原位PCR可以在细胞悬液、细胞涂片、细胞离心标本、石蜡切片及冰冻切片上进行。相比之下,以悬浮的完整细胞做原位PCR效果最好,细胞涂片和细胞离心标本次之,而切片标本最差。原位PCR最理想的固定方法应该既能保护DNA或RNA,又能保护组织的形态。常用的固定剂,缓冲福尔马林(10%,4℃固定4-6h)和4%的多聚甲醛,一般都能满足这一要求。Greer等用经固定的石蜡包埋组织做PCR,检查了11种固定剂、3种固定时间对PCR的影响。他们的结果可为原位PCR组织固定法的选择提供参考2.2污染条件对pcr的影响在进行原位扩增之前,一般都要用蛋白酶进行预处理。组织标本经蛋白酶消化后,能增加透性,允许试剂进入,并暴露靶序列用以扩增。酶的浓度、处理时间和温度很重要。过渡消化会扭曲组织形态,使得PCR产物从破坏的细胞膜内扩散出来;如果消化不够,组织将会有较差的渗透度以及蛋白质和核苷酸的交联过度,会影响PCR反应。这些都会导致假阴性结果。消化的强度还应与组织的固定程度相适应组织样品固定越深消化也要越强些消化后酶要通过加热去活化或洗脱完全除去。2.3原位pcr方法原位PCR非特异性或假阳性的产生在很大程度上来源于引物与模板的错配。因此,设计一对和组织中其他序列很少或没有同源性的引物是十分重要的。现在已有一些计算机程序用于证实所设计的引物的同源性。引物通常含18-28个核苷酸,对于保存在石蜡切片中的组织样品,适合用较短的引物,有时为提高扩增产物的特异性,可以采用2对或多对引物。原位PCR和液相PCR的扩增原理基本相同,但由于原位PCR在固定的细胞、组织标本上进行,因而又有其特殊性。原位PCR中,靶序列DNA或RNA是不移动的,由于空间位置的缘故,不是所有的靶序列都可以与引物结合而获得扩增。一般认为原位PCR效率低于传统PCR。为获得较好的扩增效率,引物和DNA聚合酶的浓度比传统PCR要高一些,每一个保温时间都相应地稍长一些。对于细胞涂片、细胞离心标本或组织切片标本,扩增在玻璃载玻片上进行。载玻片原位PCR的热循环可在专用的热循环仪进行,用铝箔纸铺在常规PCR热循环仪平台上形成一个平板,也可以进行原位PCR。为获得足够的产物用于检测,一般需要20～40次循环。为提高PCR的特异性,一种“热启动”技术已发展起来。热启动最先是在载玻片已经加热94℃几分钟后,加入DNA聚合酶。现在应用“热启动”方法中,有许多改进。一种Ampliwax的特殊蜡被用在80℃以下隔开反应混合物和聚合酶;另有一种单克隆抗体能够在70℃以下特异有效阻止TaqDNA聚合酶的活性,在热循环的第一次变性步骤中,由于抗体加热去活化,从而除去它对TaqDNA聚合酶的抑制作用。原位PCR成功的一个重要因素是产物的保留。大量产物保留在原位的原因还不完全清楚。细胞膜和核膜可能对扩增产物的保留起重要作用;扩增产生的一些长的产物也可能作为一种“锚”而有效地保留一些扩增产物;带有更多组织结构的厚切片可能有助于将扩增产物保持在原位。此外,密封的盖玻片或塑料袋也可用来阻止蒸发,将产物保持在原位。PCR后处理,如60℃干燥或固定于2%～4%聚甲醛中也是一种有效的固定扩增产物的方法。2.5洗涤剂不充分原位扩增结束后,标本要轻轻地洗涤,以除去弥散到细胞以外的扩增产物。洗涤不充分,会使弥散的扩增产物在检测时显现,造成背景过高或假阳性结果,而过分的洗涤可能会从起始位置除去扩增产物。因此,洗涤的程度要折衷于减低背景和保留强阳性信号这两个因素。2.6pcr前杂交间接原位PCR反应的扩增产物是通过原位杂交来检测的。杂交前通常要进行预杂交。预杂交也可在PCR前进行,这种修改能减少洗脱的步骤和次数,同时有利于保存扩增产物。原位杂交的方法很多最直接的方法是采用标记有生物素或地高辛的寡聚核苷酸探针,在甲酰胺存在下,温度37℃～54℃及适当条件下杂交3小时或过夜。此外,还有放射性同位素标记、荧光标记、酶标记等多种检测方法。2.7原位pcr检测dna和rna原位PCR是一种敏感性很高的检测细胞内特定DNA或RNA序列的新技术,其整个流程相当复杂。不适当的固定和预处理、不适当的引物、缺损DNA的修复以及产物的扩散等都将会产生假阳性或假阴性结果。为了使实验结果得到正确、合理的解释,必须设置一系列对照实验。理论上每次实验需要有20多个对照,在实际操作中,为保证反应的特异性,以下对照要首先考虑。(1)同时扩增一个已知阳性和阴性的样品中的靶序列作为对照。该对照样品最好是与待测样品相似的组织或细胞。(2)从同一样品中提取DNA或RNA,在载玻片上作液相PCR或RT-PCR。(3)将数量已知的不含靶序列的无关细胞与含有靶序列的细胞混合或在同一组织中设置相邻的阳性和阴性,用以区别由于扩增产物扩散而造成的假信号。(4)省去TaqDNA聚合酶进行原位扩增作一个阴性对照。(5)省去引物或用无关引物代替特异性引物进行原位扩增作为一个阴性对照,用作检测DNA聚合酶作用下的缺损DNA修复的对照。(6)原位扩增之前用DNA酶或RNA酶预处理待检测标本作为一个阴性对照。(7)省去探针或省去标记的引物作为检测体系的对照。3低小分子分析技术原位PCR技术是一种将PCR技术的高度敏感、高效扩增的特点与分子杂交方法精细定位的特点紧密结合在一起发展起来的分子分析技术。它在原位检测低拷贝基因及基因低水平的表达方面有着其独特的优越性。这一技术从建立以来就受到国外有关研究领域许多学者的重视,近年来,国内亦有了少数报道。目前原位PCR主要应用在三个领域:外源基因检测,基因变异的鉴定和基因表达研究。3.1外源基因检测3.1.1原位rt-pcr检测aids系统的细胞系统许多疾病是由于细菌真菌病毒等感染而引起的。应用原位PCR对艾滋病毒(humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV)进行研究,导致了许多重大发现。Bagasra等人[12—14]用间接原位PCR分析了11个HIV血清阳性病人的外周血大单核细胞的感染情况。其中8个病人被发现含有HIVDNA序列,而这8例用传统的原位杂交方法未能检测出来。继而他们还分析了56个HIV血清学阳性和11个血清学阴性病人的外周血大单核细胞。发现血清学阳性患者有0.1～13.5%细胞携带有HIV基因组序列,而且病毒的强弱还与疾病时期有关;血清阴性的病人大单核细胞无一例有阳性信号。其中的42例CD4T淋巴细胞有HIV感染的占0.2%到69%。随着阳性率的增高,病情也在进展。Nuovo等用直接原位PCR对外周血细胞进行了研究,也观察到同样的结果。他们在所研究的10个AIDS病人的外周白细胞中检测到HIV-1DNA,阳性细胞占周围淋巴细胞的1.8～6.2%。Patterson等在可能有HIV感染的病人血细胞中进行原位RT-PCR。扩增信号和荧光标记的探针杂交,然后通过流式细胞光度术将细胞分成HIV阳性和阴性细胞。对前病毒DNA和mRNA分析显示,HIV基因存在于大量的潜伏感染细胞群中。原位PCR还可以从经母亲感染的18个月前的婴儿体内,在其他方法检查血清成阳性反应之前检测出艾滋病毒。Embretson等对HIV序列作原位PCR用以检查艾滋病病人的淋巴结中的CD4淋巴细胞。从感染早期到晚期,整个淋巴系统中有非常大量的潜伏感染的CD4淋巴细胞和巨噬细胞含有HIV病毒;HIV和树状滤泡细胞之间的亚细胞之间的联系也已被证实。当这些细胞通过淋巴小囊移动时可能将会感染其它细胞。Zevallos等对艾滋病病人的胎盘进行了研究。其结果提供了认识HIV垂直传染的形态学基础。以上研究为HIV的研究展现了一幅新图像,艾滋病毒的复杂致病机理将被逐步揭示。Zehbe等应用原位自我再生式序列复制反应(3SR)技术对宫颈癌SiHa细胞系中单拷贝人类乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)的游离基因进行了检测。结果表明:常规原位分子杂交只能显示很弱的癌细胞浆中HPV16E6mRNA信号,经过3SR扩增后,胞浆内可见到很强的阳性信号。运用原位PCR和原位RT-PCR还研究了许多保存的组织样品和细胞系中的其它病毒感染和细菌感染。包括乙肝病毒,丙肝病毒,单纯疱疹病毒,麻疹病毒,脊髓前角灰质炎病毒和结核杆菌等。利用原位对这些病毒的检测既提高了敏感性也达到了组织细胞定位的目的。3.1.2外源基因的检测随着分子生物学和基因工程的迅速发展,越来越多的人从事转基因研究,在动、植物转基因方面已有不少成功的例子,在转基因动物成功的基础上发展起来的人的基因治疗正显示着美好的发展前景。对导入基因进行检测在转基因研究中是极端重要而又必不可少的。Southern印迹、PCR、原位分子杂交是检测外源基因的传统手段,新发展起来的原位PCR在检测外源基因方面特别有用。Yin等对哺乳动物中枢神经系统导入的外源基因进行研究。他们以缺陷单纯疱疹病毒为载体,向脑内导入功能基因—前脑啡肽原启动子,观察动情素。在每个转基因实验中,用原位PCR都可以在脑内神经细胞中显示1个拷贝的DNA,而常规原位分子杂交则不能。该方法对导入基因本身进行检测,能追踪和定出转入基因的确切位置,从而很好地克服了目前采用的标记基因的缺陷。因为导入的基因并不一定能表达,也不一定能转录、翻译蛋白质和发挥功能作用。因此,可预料原位PCR检测将在研究导入基因的遗传稳定性、基因工程应用以及基因治疗等方面有着重大的意义。3.2原位反转录pcr检测生物体具有遗传和变异的特性,当机体内外环境改变时,有的基因会发生改变,随之也可能发生相应的功能改变。原位PCR能用于基因突变、基因重组和染色体易位等基因变异研究。Embleton等用原位反转录PCR技术,在单个细胞内显示了扩增拼接重排的免疫球蛋白重链及轻链可变区基因。Long等对一个人鼠杂交瘤细胞系Con进行了研究。该杂交瘤细胞中有一稳定的染色体14及18易位。利用一对特异性引物分别进行PCR、原位杂交及原位PCR。结果证明,原位PCR是检测单个细胞中低拷贝DNA最有效的方法。Tokusashi等运用原位PCR技术区分鼠肝组织切片中正常的清蛋白基因和发生突变的清蛋白基因。此外,应用此技术还可鉴定一些单个细胞种类获得或遗传的特定DNA序列改变。3.3原位rt-pcr和新体对克氏原螯虾mrna的定位表达原位RT-PCR技术能够反转录mRNA到cDNA,然后原位扩增cDNA来检测mRNA的表达。它可用于检测固有内源性基因表达和导入的外源基因表达两方面。其定位水平从组织细胞水平逐渐发展到了亚细胞水平和染色体上等对不同组织细胞的表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)的mRNA,用原位反转录PCR的方法,以对特异性序列为引物进行检测。EGFR在分