非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因表达及临床意义

非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因表达及临床意义

肺癌是目前发病率和死亡率最高的肿瘤，其治疗也是一个吸引人的焦点。以往的化疗和放疗由于缺乏特异性，虽然愈合，但往往给患者带来严重的副作用。因此,选择肺癌细胞特异的分子靶点,应用针对该靶点的药物进行治疗,在取得明显疗效的同时又避免对正常细胞的伤害的治疗模式,越来越被肿瘤学术界和广大患者所认同。肺癌分子靶向治疗常用的治疗靶点有:细胞受体、信号传导和抗血管生成等,其中表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是目前最为主要的靶点。表皮生长因子受体在细胞信号传导通路中起重要作用,一旦被激活,可导致肿瘤细胞内酪氨酸蛋白激酶活化和受体自身磷酸化,从而促使细胞增生、分化、转移、血管生成及凋亡抑制。EGFR受体抑制剂包括小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitor,TKI)和单克隆抗体。EGFR-TKI通过阻断细胞受体的三磷酸腺苷结合位点,阻止下游信号传递而产生抑制肿瘤作用。目前,有两种EGFR-TKI(厄罗替尼和吉非替尼)成功在中国上市,其药物特点是口服、高效、高特异性,病人耐受性好,无骨髓抑制和神经毒性,能显著延长敏感患者生存期,改善患者生活质量。但是,大规模的临床实验中亦发现,在不同的病人中EGFR-TKI的疗效差异很大。对未经选择的病人,使用EGFR-TKI的总有效率为8%-12%;而在非吸烟、女性和亚洲人中,有效率高于20%。2004年,Lynch和Paez等首次提出,EGFR-TK对不同NSCLC的治疗效果的差异是由于EGFR外显子的突变状态不同。EGFR外显子19或/和21的突变异常将导致EGFR结合ATP的能力增加,从而加强了TKI的疗效。在不同种族的人群中EGFR的突变率存在显著差异,如Kosaka等报道,日本的NSCLC患者EGFR外显子突变率明显高于美国人和欧洲人。此外,Cappuzzo等亦报道,通过荧光原位杂交检测EGFR的扩增,发现存在EGFR扩增的患者对TKI的疗效较好。由于EGFR的突变和拷贝数扩增状态与TKI的疗效紧密相关,而且在不同种族的人群中,EGFR的突变状态存在很大的差异。本研究拟以我院肺外科收治的187例非小细胞肺癌患者为研究对象,采用Real-timePCR技术检测EGFR基因19、21外显子的突变,并采用荧光原位杂交(FISH)技术检测EGFR基因的扩增情况,从而分析其与患者临床病理生理特征的关系,探讨EGFR存在状态在肺癌发生发展中的作用,为晚期NSCLC的个体化治疗打下基础。1材料和方法1.1病例选择及组织分型选取天津医科大学总医院2006年-2009年8月间手术切除并经病理确诊的非小细胞肺癌标本187例。其中,男性125例,女性62例;年龄31岁-83岁,中位年龄为62岁;有吸烟史的病人119例;根据ICC1997年新的修订标准进行TNM分期,I期53例,II期22例,III期99例,IV期13例;有淋巴结或/和远处转移者100例;按WHO肺癌组织分类标准进行组织分型,鳞癌96例、腺癌76例、腺鳞癌7例、大细胞肺癌8例。所有患者术前均未接受过化放疗和EGFR-TKI治疗等抗肿瘤治疗。所有标本均以10%福尔马林固定,常规石蜡包埋封存。生存时间从术后第1天算起,截止至2009年11月14日。1.2egfr基因检测采用Real-timePCRTaqman探针技术分析肺癌患者石蜡组织中EGFR外显子19、21突变状况。石蜡组织DNA提取采用TAKARA试剂盒并按说明书步骤进行。首先将3片-5片10μm厚的石蜡切片放于Eppendorf管中,加入DNA抽提液10滴,充分混匀,100oC加热10min,13000rpm离心10min,吸取其上清直接用于RealtimePCR。EGFR基因突变实时荧光定量PCR法检测试剂盒由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供,采用Taqman探针技术检测EGFR基因外显子19delE746-A750(delIa)、delL747-P753insS(delIb)突变以及外显子21L858R、L861Q的突变。PCR反应体系包括:模板、正反向引物、MasterMix及Taqman标记探针del-E746-A750、delL747-P753insS或L858R、L861Q探针。每次实验均设定各突变的阴、阳性对照孔及空白对照孔。反应循环参数为:50oC2min,95oC10min以激活DNA聚合酶;95oC15s,62oC1min,循环40次。Real-timePCR仪为美国ABI公司7500型。结果判读:以无模板对照扩增曲线的最高点为准设定阈值。没有出现扩增曲线或Ct值=0的样本为阴性样本;出现扩增曲线且Ct≤34.0的样本为阳性样本;34.0≤Ct≤38的样本为可疑阳性,需重复。1.3egfr基因检测采用FISH技术检测EGFR基因扩增,FISH检测试剂盒由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供,其中,人7号染色体中心粒探针有FITC标记(呈绿色荧光信号),EGFR探针有Rhodamine标记(呈红色荧光信号),具体实验步骤按说明书进行。首先对经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋的肺癌组织切片(3μm厚)进行室温二甲苯脱蜡2次,每次10min,随后将组织切片依次置于100%、85%和70%乙醇各2min。然后在50oC下用30%[w/v]酸性亚硫酸钠处理组织切片20min-30min后,用90oC水煮30min,以去除核酸表面的蛋白质。2×SSC溶液漂洗后,200μg/mL蛋白酶K37oC消化30min。之后与经变性后的相关探针在42oC杂交16h,经SSC洗涤,DAPI复染,最后在荧光显微镜下判读。结果判读标准:计数至少100个细胞,统计Ratio值。Ratio值=100个细胞核中红信号总数/100个细胞核中绿信号总数。若Ratio<2为阴性结果,提示该样本无EGFR基因扩增;若Ratio>2为阳性结果,提示样本中EGFR基因发生扩增;此外,若>10%的细胞中存在大于或等于15个红色信号或存在成簇的红色信号的,或>40%的细胞中红色信号个数大于或等于4的,均为阳性结果,提示样本中EGFR基因发生扩增。1.4实验数据的统计采用SPSS10.0软件进行统计学分析。实验数据以Mean±SD表示。采用的统计学方法有t检验、双变量相关性分析等。以P<0.05为具有统计学差异。2结果2.1egfr基因检测本研究组共有187例患者,其临床病理生理特征见表1。其中,年龄按中位数分为≥62岁和<62岁两组。EGFR基因在肿瘤细胞中拷贝数增加包括两种情况:EGFR高多倍体扩增和成簇扩增。EGFR高多倍体扩增是指Ratio>2,或者>10%的细胞中存在大于或等于15个红色信号,或者>40%的细胞中红色信号个数大于或等于4的;此外存在成簇的红色信号的,为EGFR成簇扩增,均为阳性结果,提示样本中EGFR基因发生扩增(图1)。EGFR基因拷贝数增加与患者临床病理生理特征的关系如表2所示。在187例病例中,EGFR扩增阳性病例89例(89/187,47.6%),其中,男性61例(61/125,48.8%),女性28例(28/62,45.2%);腺癌42例(42/87,48.3%),鳞癌42例(42/98,42.9%),腺鳞癌5例(5/10,50.0%),大细胞肺癌4例(4/5,80.0%)。经统计学分析,EGFR基因扩增阳性病例在不同年龄、性别和组织学类型的患者中的分布没有统计学差异(P>0.05);同时,亦与患者吸烟与否以及是否伴有肿瘤的转移均无关(P>0.05)。进一步对EGFR基因不同外显子突变情况分析发现,在EGFR突变的38例患者中,外显子19的突变率为36.8%(14/38),明显低于外显子21的突变(71.1%,27/38)(P<0.05)。其中,外显子19的突变以delE746-A750型(delIa)为主,有11例(28.9%,11/38),而delL747-P75insS型突变(delIb)只有3例(7.9%,3/38);而在本组病例中,27例外显子21的突变均为L858R型突变(71.1%,27/38),未见L861Q型的突变。3例病人为外显子19和21的双突变(7.9%,7/38)。因此,在本组病例中,EGFR外显子21的突变率高于外显子19,而在外显子19的突变以delE746-A750型为主,外显子21的突变以L858R型为主。2.4egfr基因异常在187例患者的正在随访中,截止2009年11月15日现仅有78例患者具有完整的预后资料,其中死亡病例20例,至今生存病例58例。我们随后对78例患者依据EGFR基因的突变或/和基因扩增进行了生存期的初步分组分析。依据EGFR基因外显子突变将患者分为EGFR基因突变组和无突变组;依据EGFR基因扩增将患者分为EGFR基因扩增组和无扩增组;依据EGFR基因异常(突变+扩增)将患者分为EGFR基因异常组和正常组。如图2A所示,EGFR突变阳性组患者14人,中位生存期为704天,突变阴性组患者64人,中位生存期为577天,两组生存曲线之间亦无统计学差异(P>0.05)。在EGFR基因扩增的分析中发现,EGFR基因扩增阳性组患者38人,中位生存期为670天,而阴性组患者40人,中位生存期为546天,两组生存曲线之间比较,EGFR基因扩增患者要明显好于无扩增的患者,虽然目前在统计学上尚无差异(P=0.054)(图2B),但已有明显的趋势。进一步我们把EGFR基因突变或/和扩增联合在一起分析发现,EGFR基因异常组43人,中位生存期为599天,正常组35人,中位生存期为546天,虽然EGFR异常组患者生存期要高于EGFR基因正常组,但两组生存曲线之间亦无统计学差异(P=0.185)(图2C)。由于本组病例随访时间短,且尚未完成所有病人的随访,故没有再进一步进行Cox多因素回归分析。2.5厄洛替尼治疗由于本研究为回顾性研究,在上述病例中目前已有16例患者经过了EGFR-TKI的治疗(厄洛替尼和吉非替尼治疗患者各8例)。其中,6例(37.5%,6/16)患者肺癌进展取得了有效的控制。在这6例患者中5例(83.33%,5/6)具有EGFR外显子19(3例)或21(2例)的突变,1例患者仅有EGFR基因的扩增而无EGFR外显子的突变。6例患者中女性患者4人,腺癌4例,鳞癌和腺鳞癌各1例。以下为2例厄洛替尼治疗有效患者。患者甲,女,63岁,主因“间断咳嗽、气短2月余”于2009年6月20日住院治疗,CT示右侧胸腔积液,右胸膜多发结节。于6月25日全麻下行VATS右胸膜活检,胸膜固定术。病理:右胸膜转移性低分化腺癌,CEA(+),Calretinin(-)。于术后行4个周期GP方案化疗,复查CT示右胸膜多发结节较前无明显缩小。遂于2009年10月9日服用靶向药物厄洛替尼治疗,1个月后复查胸部CT示右胸膜多发结节基本消失,胸膜变薄(图3)。患者乙,女,51岁,于2008年2月因查体发现右上肺占位,在深圳一家医院以肺结核球抗结核治疗(图4A)。2008年11月在抗结核治疗过程中出现头痛、颅内高压等脑部症状,复查胸部CT(图4B)显示右上肺占位增大,头颅MRI示颅脑出现转移灶。遂于2008年12月行颅脑转移瘤切除术,术后病理报告为腺鳞癌。术后行GP化疗1个周期和全脑放射。因标本检测为EGFR基因外显子19delE746-A750,遂于2009年2月末起服用厄洛替尼治疗。1个月后复查胸部CT示原发灶明显缩小,此后长期服用厄洛替尼。最近头颅MRI、胸CT复查均显示病情控制良好(图4C)。3egfr基因突变与tki的关系大规模的临床试验已经表明酪氨酸激酶抑制剂EGFR-TKI在晚期非小细胞肺癌中的疗效和生存上的优势。已有多家报道证实EGFR-TKI的疗效与EGFR外显子的突变和基因扩增明显相关。EGFR基因的突变89%集中在19外显子的缺失和21外显子的L858R错义突变。Paez等率先分析了119例NSCLC患者的突变与临床特征,发现EGFR突变发生率在腺癌中高于其它病理类型,女性高于男性。本研究通过对187例NSCLC患者EGFR最常见的19外显子两种缺失突变和21外显子的两种错义突变进行检测,结果与上述报道相似:EGFR突变发生在不同性别和病理类型的病例中有明显差异,腺癌和腺鳞癌的突变发生率高于其它病理类型;女性突变发生率高于男性。此外,非吸烟者中的突变率高于吸烟者。这些特点具有重要的意义,因为EGFR的突变与否与TKI的临床疗效相关。腺癌患者占NSCLC的大约40%,而大规模的临床实验表明,大约三分之一的患者在使用TKI后,疾病得到控制。本研究发现,在中国的NSCLC患者中,20.3%(38/187)的患者存在EGFR外显子19或/和21的突变,EGFR的突变状态与患者的病理类型、性别、吸烟状况有关:女性、腺癌、非吸烟者中EGFR外显子19、21的突变率显著高于其他患者,是选用TKI治疗的优势人群,这与国外文献报道相符。因此,在选用患者时应该考虑这些因素。以往的研究表明,EGFR拷贝数增加的NSCLC患者的生存时间较无EGFR拷贝数增加的患者短。我们通过FISH检测发现,在这组病例中47.6%(89/187)的患者存在EGFR基因拷贝数增加,EGFR基因的拷贝数增加与否与患者的年龄、性别、组织学类型、肿瘤大小、分期、是否转移及吸烟状况无关。但EGFR突变与拷贝数增加具有一定的相关性(P=0.012)。在EGFR突变阳性的患者中,大部分具有EGFR基因拷贝数的增加(65.8%,25/38),而在EGFR基因扩增的患者中,亦有28.1%(25/89)的患者具有EGFR基因突变。进一步分析发现,在早期患者、腺癌患者和非吸烟的女性患者中,EGFR外显子19和21的突变与EGFR拷贝数增加具有一致性:大部分突变阴性的患者FISH亦为阴性;大部分突变阳性的患者FISH亦为阳性。Han等观察了东亚地区NSCLC患者的EGFR基因突变、拷贝数增加和KRAS突变情况与患者的长期生存后,认为EGFR突变是影响TKI疗效的独立的变量;而FISH阳性也提示患者对TKI的反应较好,但生存时间并不能显著延长。虽然现在文献报道的EGFR酪氨酸激酶结构域的突变已经达30余种,但大致可分成3类:外显子19的缺失、18、21外显子的单核苷酸的替换突变及20外显子的复制突变。而外显子21的L858R和外显子19的缺失突变占突变的绝大多数,被认为是活化性突变。L858R单核苷酸的替换突变靠近保守的Asp-Phe-Gly序列,突变使A-loop的稳定性增加。而外显子19的缺失突变靠近alpha-C-helix,而后者控制着与ATP结合囊的角度,突变使ATP结合囊变窄。Mitsudomi等注意到两种突变在使用TKI后的反应有差异:在使用厄洛替尼或吉非替尼后,EGFR外显子19缺失突变的患者有效率高于具有L858R突变的患者,且生存时间较L858R突变患者长。我们的研究发现,EGFR突变具有性别差异,目前现在还没有很好的解释。但是,推测与雌激素有关。激素本身有可能就是一个致癌剂。比如,绝经期前的女性NSCLC患者肺癌往往更具侵袭性,而且,有作者报道,EGFR通路和雌激素受体间存在相互作用,比如,在NSCLC细胞株中和小鼠移植模型中,雌激素受体拮抗剂和吉非替尼间具有协同效应,但雌激素在NSCLC发病中的确切机制还需进一步阐明。吸烟状态也影响着EGFR的突变率。我们的研究发现:在非吸烟者中,突变率36.8%(21/57)远远高于吸烟者9.3%(10/107);在腺癌患者中,非吸烟患者的突变率为43.6%(17/39),吸烟患者的突变率为15.2%(5/33)。有作者报道,在现在吸烟、以前吸烟和从不吸烟的NSCLC中,EGFR的突变率分别为:3%、8%和20%,这表明有一种趋势:吸烟与EGFR的突变有负相关。而烟草不是非吸烟患者EGFR突变的致癌剂,而EGFR突变才是非吸烟患者最早的分子改变。我们的研究发现,EGFR基因突变和拷贝数增加在NSCLC中非常普遍,而大多数突变的病人都具有EGFR拷贝数的增加,二者具有相关性。但两者的相互关系如何、哪个更早发生尚不明确。有作者通过显微切割,将具有突变的肺癌组织和其周围的正常呼吸道上皮分开,发现突变往往局限在肿瘤组织中,很少在距离肿瘤组织远的地方发现突变;而通过分析原发肿瘤组织、周围的正常呼吸道上皮和转移性癌组织,研究发现,拷贝数增加在原发肿瘤和转移肿瘤中可见,而在肿瘤周围的正常呼吸道上皮中少见。因此,推导了EGFR突变和拷贝数增加在肺癌发生中可能的机制。由于肺癌的发生是一个多步骤的过程,从癌前病变、原位癌到进展期癌最后发展为转移性癌。多位作者通过分析了不同阶段的肺癌组织后,提出突变是早期、侵袭前的改变;而拷贝数增加是晚期的、与侵袭相关的改变。因此,突变的发生早于拷贝数增加,而拷贝数的增加往往带有转移的表型。综上所述,EGFR基因突变率在不同的NSCLC患者中不同,其中,在女性、腺癌和非吸烟患者中突变率高;EGFR基因扩增与患者的性别、组织类型、吸烟状态等临床特征未见相关性,但可能与患者的预后相关。有EGFR基因突变的患者对TKI治疗疗效较高。因此,在肺癌的个体化治疗中检测EGFR基因的突变具有重要的临床指导意义。2.2egfr基因外显子的基因特征:病理与病例分析如表3所示,在187例病例中,共有38例(20.3%,38/187)患者发生了EGFR外显子19和21的突变。其中,腺癌患者的突变率为35.5%(27/76),远远高于非腺癌患者(9.9%,11/111)(P=0.000)。在非腺癌患者中,鳞癌突变率为7.3%(7/96),腺鳞癌为28.6%(2/7),大细胞肺癌为25%(2/8),其中,虽然腺鳞癌和大细胞癌突变率较高,但由于其病例数相对偏少,故需要更多的病例来进一步分析。这些结果提示