动物肠道菌群分子育种研究进展

动物肠道菌群分子育种研究进展

动物肠道菌群的正式研究始于巴斯德（l.paseur）和克里夫（r.koch）对细菌学的研究，提出了必要的消毒和纯培养法技术。特别是以柯赫于1881年开创的纯培养法为开端,1885年埃希氏由乳儿粪便中分离出大肠埃希菌,才开始了肠道菌群的系统研究。1933年由Eggerth和Gagnon明确了肠道厌氧菌问题,1957年由东德的Haenel、SlanetzandBartley证明了在人、家畜、家禽肠道菌中厌氧菌占95%以上,最优势菌是包括乳杆菌或双叉杆菌在内的厌氧菌,完全改变了19世纪末认为大肠埃希菌和肠球菌是优势菌的看法。进而指出在肠道菌丛检查中必须加用高度厌氧培养法和培养基。1969年,B.S.DrasarandMargotShiner大致确立了肠道菌丛检查法,几乎所有菌都能用直接涂抹方法培养。以确立这样的肠道菌丛培养法为开端,开始了对人和动物肠道菌丛的微生态学研究。到目前为止,肠道菌群结构的分析研究方法主要有以下几种。1分离培养法对微生物多样性的分析在DNA分子技术出现之前,人们对肠道菌群的认识大多数是靠纯培养或靠直接形态观察来获得部分信息。用纯培养方法分析微生物群落结构,就是通过对不同的微生物人为地设计多种适合的培养基和培养条件尽可能分离样品中所有微生物,进而对微生物群落结构和微生物的活性进行分析。在最初开始微生物生态学研究时,如土壤微生物的研究,这种传统的分离纯培养方法用的最多。分离培养技术也分析了人体和动物肠道内定居着的大量微生物。1974年Morre和Holdeman对20例男性的(地理位置上涵盖了日本到夏威夷)粪便样中微生物的种类和相对数量通过分离培养法做了统计分析研究,培养得到了1147个纯培养物,鉴定为3个不同种的微生物。但这种分离方法,也可能会漏掉那些数量很高,但营养条件要求苛刻的菌。1989年Hirayama等和1988年Zhang等也分别用培养的方法对大熊猫肠道菌群的多样性进行了调查研究。Zhang等发现大熊猫肠道内的优势菌群为E.coli而Hirayama等发现大熊猫肠道内优势菌为Streptococcus和Terobacteriaceaee。事实上,自然界中,很大一部分细菌是不能通过实验室培养得到纯分离物的,原因是有些微生物要求的生长条件苛刻,有些是绝对的严格厌氧菌,还有些是在自然环境中与其他微生物形成共生关系。实验室很难模拟自然环境的条件,因而无法得到其纯培养物。因此,用这种传统的培养方法来研究某一微生物生态系统中微生物的多样性,必然存在着局限性,不能给出一个系统中微生物的全貌。而且肠道内微生物大多都是厌氧菌,若以这部分能够被分离培养的微生物来代表肠道中复杂的微生物菌群也必将导致极大的偏差。现在很多学者利用分子生物学的手段来研究微生物生态系统,然而,无论分子生物学的手段如何先进,对自然界微生物的研究,最终仍然希望能够得到尽可能多的纯培养物,在种的水平上详细研究其生理生化特征和功能。2利用菌株的指纹图谱检测细菌基因组dna1991年Hulton等首次在E.coli、Salmonellatyphimurium及其他肠道细菌基因组中发现了ERIC(EnterobacterialRepetitiveIntergenicConsensus)序列,即肠杆菌基因间保守重复序列。ERIC实际上是一对长度大于16碱基的引物,ERIC-PCR是一种“长引物随机PCR技术”。同年,Versalovic等发明针对ERIC序列设计引物并进行PCR扩增的技术,以用于对细菌的基因组DNA进行指纹图谱分析,并将该技术申报专利。此后,ERIC-PCR技术就被广泛应用于细菌分类和菌种鉴别上,也被用来设计专一性的探针和引物用于检测环境和临床样品中目标菌的存在情况。1999年DiGiovanniG.D.等用ERIC-PCR分析6种可培养的纯菌组成的混合菌图谱,获得了高重复性的指纹图谱。2003年潘莉等、2004年Wei等、2005年鲁海峰等、2007年徐灵筠等以ERIC-PCR指纹图谱技术为手段,分别对腹泻儿童、人及仔猪、大熊猫、糖尿病小鼠肠道菌群结构做了比较分析,均获得了清晰、可重复的图谱。大量研究结果表明,ERIC-PCR指纹图谱技术可成功地分析不同肠道菌群的组成并动态监测菌群随时间或环境因素影响而变化的过程,具有快速、重复性强、灵敏度高等优点,克服了传统培养方法费时、费力、选择性强的缺点,是对目前已经普遍使用的各种16SrDNA基因多样性分析方法的必要补充。根据ERIC-PCR指纹图谱提供的线索,就可以找到一些与功能相关或有特殊生态意义的DNA片断,或在此基础上结合群落分子杂交技术以寻找一些特定微生物群落的“标记序列”。3srrna扩增、克隆及测序16SrDNA的分子测序技术主要包括DGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis,变性梯度凝胶电泳),TGGE(温度梯度凝胶电泳),16SrDNA克隆文库和16SrDNA高通量测序。3.1快速检测16srdna的分子分型分子生物学技术的应用克服了传统分离培养方法的限制,使得微生物学者可以从基因水平上估计种的丰度、均度,查明种的变异情况等,从而可以客观的认识微生物天然的生态状况。其中PCR-DGGE/TGGE是近几年在国内外应用比较广泛的分子技术之一,它是基于16SrDNA的可变区PCR扩增子的序列特异性变性浓度/温度不同进行分离的,并且可以检测出序列中1个核苷酸的差异。因此通过该技术直接扩增16SrDNA的可变区V3/V6/V8,通过DGGE构建DNA指纹图谱,建立快速检测的分子分型平台,每一个条带代表某个微生物优势菌群,通过测序和序列比对,可以得出此优势菌群的种类,能检测到难以或不能培养的微生物,更能精确反映肠道菌群结构的动态变化。因此广泛用于肠道复杂微生物区系菌群结构演替和多样性分析研究,如对粪便中乳酸杆菌种类的分析,服用不同食物(如药物、益生素等)后肠道菌群的变化等。3.21srrna测序16SrDNA文库是16SrDNA这1542个碱基遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中,这个群体就是16SrDNA克隆文库。一般通过构建λ噬菌体、Cos质粒、YAC人工酵母等方法构建。将16SrDNA基因的扩增和纯化后与载体连接,再转化到大肠埃希菌感受态细胞中,通常所构建的文库只有经蓝白斑筛选、菌落PCR和质粒双酶切鉴定为含有目的基因片段的阳性克隆子才能进行测序。也可以直接采用454平台对16SrDNA-PCR产物进行高通量测序法。将所测的全部16SrDNA基因序列导入RibosomalDatabaseproject数据库ChimeraCheekv2.7(/cgis/chimera.cgi?su=SSU)进行序列分析检测,以去除嵌合和错误序列,再去掉序列中的16SrDNA基因引物及其上下游序列之外的序列,去除载体及引物序列的细菌16SrDNA基因序列与GenBank及RDP数据库中细菌序列进行相似性比较分析,从中得到相似高的序列,以鉴定各测序序列的细菌所属类型。2009年HusenZhang等将16SrDNA-PCR得到的184094个序列,通过454高通量测序技术对比分析了6个肥胖人和3个正常人的肠道菌群结构差异,系统进化分析表明尽管人的肠道菌结构十分不同,它们的差异主要集中在6大分支3个群尤其是厚壁菌门在正常体重人群中占优势,而肥胖人在其经过胃时极度下降,但变形菌门细菌有一定比例的上升,产氢普雷沃氏菌科在肥胖人体中高度丰富。4荧光原位杂交技术自从1995年PSLangendijk等采用了16SrDNA荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization,FISH)分析了人粪样中双歧杆菌的种属,1998年AHFranks等分析了人粪样中细菌种群的多样性之后,2000年AMoter等对荧光原位杂交技术在使微生物群的可视化研究中的作用进行了肯定,该技术不但对可培养微生物且对不可培养微生物也可进行探测。2005年ASwidsinski等采用荧光原位杂交技术分析了小鼠正常和发炎肠道菌群的空间结构。目前以16SrDNA为靶序列的寡核苷酸探针荧光原位杂交技术已广泛应用于分析环境中复杂的微生物群落构成。5宏基因组学的原理虽然16SrDNA杂交或PCR技术被广泛用于微生物多样性的研究,但这一技术无法提供肠道中未培养微生物的遗传、代谢和生理生化等方面的信息,而宏基因组学研究可以弥补上述不足。宏基因组是指样品中全部微生物的基因组,包含了可培养和未培养的微生物基因组,由Handelsman于1998年首次提出。宏基因组学(又叫元基因组学,Metagenomics)就是一种以样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。在宏基因组学研究中,借助于大规模测序,结合生物信息学工具,能够发现大量过去无法得到的未知微生物新基因或新的基因簇,这对了解胃肠道微生物区系组成、进化历程和代谢特点,挖掘具有应用潜力的新基因具有重要意义。2012年QinJ等采用二阶段宏基因组关联研究方法(two-stageMGWAS)通过基因组高通量测序研究了来自中国的345个肠道样本的微生物基因组和组成差异,找到了2型糖尿病在宏基因组学上的物种分类和基因功能标记约6000个。宏基因组学研究的技术路线见图1。5.1微生物群体基因的组成及功能宏基因组测序,是对特定环境(如动物肠道)样品中的微生物群落基因组进行高通量测序,以分析微生物群体基因组成及功能,解读微生物群体的多样性与丰度,探求微生物与环境、微生物与宿主之间的关系,发掘和研究新的、具有特定功能的基因。宏基因组测序(常用454测序技术)研究避开了微生物分离培养的过程,扩展了微生物资源的利用空间,为微生物的研究提供了有效工具。5.2功能驱动筛选和生物信息分析在宏基因组学的研究程序中很多是采用构建基因组文库的路线,克隆DNA到合适的载体,如λ噬菌体,Fosmid和BAC(bacterialartificialchromosome),再将载体转化导入宿主菌体(大肠埃希菌)便建立了其宏基因组文库。在宏基因组学分析中,靶基因可能只占环境总基因的很小一部分,因此,必须对样品或基因采取富集技术,对文库进行筛选,目前常用的文库筛选方法是基于功能驱动筛选法和序列驱动筛选法。根据微生物生理和生化特点,可利用选择性培养基对样品富集培养。基因富集能获得大量高纯度DNA,有助于研究特殊微生物群体。如稳定同位素探针技术(SIP)已被广泛应用于研究参与特殊物质代谢的个别群体;抑制性消减杂交法(SSH)可以选择性的扩增差异表达目的cDNA片段,同时抑制非目的cDNA的扩增;功能驱动筛选能直接获得生物活性物质,而序列驱动筛选能鉴定酶的可能代替物;底物诱导基因表达(SIGEX)法(Substrate-inducedgene-expressionscreeningmethod)是利用代谢相关基因或酶基因往往在有底物存在的条件下才表达,反之则不表达,这个原理来筛选目的代谢基因。Rees等利用羧甲基纤维素培养基富集培养微生物最终得到了4倍量的纤维素酶基因。Liles等利用16SrDNA探针筛选宏基因组文库,从中鉴定了大量未培养耐酸性细菌。功能驱动筛选方法是利用离心和选择性筛选培养基,筛选能分解底物的目标克隆,鉴定其生化和分子生物学特征。序列驱动筛选是依赖于保守序列探针或PCR引物及生物信息学内容进行筛选。利用功能驱动筛选方法已从胃肠道中获得了多种新的抗生素、新水解酶和多酚氧化酶。高通量测序结果都是用软件先进行剪辑和归类,然后在数据库中比对分析。生物信息分析包括标准信息分析和高级信息分析。标准信息分析要经过:(1)数据处理:去除低质量Reads、去除接头序列、去宿主污染;(2)组装:组装和组装结果统计、Contigs长度分布统计;(3)样品复杂度分析:组装Reads利用率统计、Kmer统计与GC-depth分析、将Reads与已测细菌基因组与GenBank肠道基因集数据库比对统计,能对序列进行系统分类。MEGAN软件是目前分析宏基因组数据的有效工具。高级信息分析也要经过3个步骤:(1)物种分类:将测序的Reads比对到已公布的微生物基因组数据库中,鉴定样品中微生物的种类分布、统计每个物种分类水平的丰度;(2)功能基因分析:对Contig≥500bp的组装结果进行基因(ORFs)预测、功能基因注释与KEGG、eggNOG数据库比对,统计每个功能集的组成;(3)多样品间的比较分析:聚类分析(物种、功能)、主成分分析(PCA)、筛选与样品分组显著相关的因子(物种、功能)等;(4)定制化信息分析:包括目标物种的高级分析(如高丰度物种、关注物种等);目标物种的功能注释结果统计;目标基因的高级分析(如高丰度基因、关注基因等);目标基因的物种注释信息统计;目标基因的KEGG代谢通路分析。16SrDNA测序技术是对16SrDNA的全序列或V3、V6、V8可变区进行测序分析的,可以达到对菌群结构和系统进化分析的目的,是用于分类研究的,而宏基因组学的方法是对样品的总DNA直接进行全基因组的宏基因组测序,可以对菌群除了进行分类研究外,