荧光原位杂交的新技术及其检测应用

荧光原位杂交的新技术及其检测应用

分子遗传的发展为对宏观细胞学和微观生物学的研究架起了一座桥梁。早期细胞遗传学的研究是建立在细胞核和染色体基本特征上的,如染色体的长短、臂比、着丝粒、端粒、核仁组织区等,荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization,FISH)的出现标志着分子细胞遗传学一个重要阶段的开始。近年来,随着物理、化学技术的发展与进步,免疫染色、量子点和微流控芯片等不断被引入到荧光原位杂交中,促进了荧光原位杂交技术和分子细胞遗传学的发展。1原聚光灯技术1.1荧光原位杂交荧光原位杂交技术是根据核酸碱基互补配对原理,用半抗原标记DNA或者RNA探针与经过变性的单链核酸序列互补配对,通过带有荧光基团的抗体去识别半抗原进行检测,或者用荧光基团对探针进行直接标记并与目标序列结合,最后利用荧光显微镜直接观察目标序列在细胞核、染色体或切片组织中的分布情况。FISH技术发展早期,是应用放射性同位素标记探针来定位目标序列的,直到1980年Bauman等才将荧光染料直接标记RNA探针的3’端,并检测到了特异的DNA;1982年Manuelidis等采用生物素标记的探针进行了染色体原位杂交。然而由于植物细胞中细胞壁的存在,非放射性生物素标记探针技术直到1985年才首次应用于黑麦中120bp重复序列在小麦染色体上的分布研究。因荧光原位杂交技术克服了放射性探针检测周期长且危害人体健康的缺点,被广泛应用于基因定位、染色体识别、物理图谱的构建、进化分析等研究中。FISH技术常用的半抗原标记物有生物素和地高辛,检测的荧光基团有异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、花菁染料(cyaninedye)和罗丹明(rhodamine)等。1.2间期细胞核的检测衡量FISH技术两个最重要的参数是分辨率和灵敏度。FISH技术从诞生发展至今已有30多年的历史,期间主要是通过改良靶标序列和探针种类来不断提高其分辨率和灵敏度的。荧光原位杂交是在染色体、间期细胞核和DNA纤维上进行DNA序列定位的一种有效手段,研究中涉及较多的是有丝分裂中期的染色体。这一时期的染色体形态较好,制片技术简单,但其分辨率较低(如分辨率水平在人类中期染色体上只有1~3Mb),难以进行精细的物理图谱构建,而且对于较小的染色体也无法识别;减数分裂期的染色体浓缩程度大大降低,比中期染色体长10~20倍,可提高杂交分辨率。番茄粗线期染色体上的FISH结果证明其分辨率可达到<100kb的水平,适于定位低单拷贝DNA序列以及遗传图谱和物理图谱的整合,但减数分裂期的染色体取材较难,制片技术也不太好掌握;间期细胞核比较容易获得,染色质浓缩程度也低于中期染色体,可在两个相距50kb左右的DNA序列间检测到信号分离。但由于缺乏可辨别的染色体形态结构,间期细胞核上的FISH无法识别不同的染色体;DNA纤维(fiber)-FISH的成功应用突破了分辨率的限制,它人为的改变了染色质原本的空间结构,通过裂解间期细胞核释放出染色质纤维,去除了组蛋白等蛋白质的束缚使DNA得到伸展,其分辨率可达到1~500kb。但DNA纤维(fiber)-FISH技术需要两个探针进行共同定位才能鉴别染色体,而且DNA纤维伸展程度不一以及随机断裂将会导致信号的长度不一。荧光原位杂交技术的探针包括重复序列、基因组序列、低单拷贝序列和大片段克隆(BAC、YAC和MAC等),其中BAC-FISH可以有效的进行低单拷贝DNA序列定位作图,还可进行遗传图谱的绘制、染色体识别等。但由于这些大片段的克隆往往含有重复序列,导致非特异性杂交信号的产生,需进一步通过序列比对将重复序列去除。随着FISH技术的不断完善与发展,已被广泛应用于DNA序列或基因的定位、核型分析、基因组进化研究、物理图谱的构建、转基因生物的鉴定等。在FISH基础上发展起来的多色荧光原位杂交(multiplex-FISH,M-FISH),可通过多色荧光同时探测多个目标,如用不同颜色的探针组合来识别人类的24条染色体。继而在M-FISH的基础上又发展了比较基因组原位杂交(comparativegenomichybridization,CGH)和三维荧光原位杂交(threedimensionalFISH,3D-FISH)技术。比较基因组原位杂交将供试材料和对照组材料的DNA用不同颜色的荧光基团进行标记,同时在对照组的染色体上进行杂交,根据产生颜色的差异来判断两个基因组相对DNA拷贝数的变化,并将其定位到染色体上。根据CGH-FISH的检测分辨原理,发展了CGH芯片技术和SNP(singlenucleotidepolymorphism)芯片技术,然后进行数字化信号采集,使FISH变成了高通量的检测技术。三维荧光原位杂交技术保持了细胞核和染色体原本的形态,并利用改善的激光共聚焦显微镜成像系统和软件的三维重构处理功能(如Metamorph软件),来研究细胞核或染色体空间结构域的组织与基因表达调控之间的关系,而4D-FISH则可应用于活细胞的检测。此外,近年来荧光原位杂交与免疫组化以及物理、化学等学科的进一步结合,推动了FISH技术的快速发展。2原纵向杂交的研究2.1荧光原位杂交的互补方法免疫染色(immunostaining)是生物化学中任何基于抗体来检测样品中特定蛋白质方法的总称。免疫染色最初是指组织切片的免疫组化染色,由Coons首先提出的,目前免疫染色已涵盖了组织学、细胞生物学和分子生物学中所应用的诸多基于抗体的染色技术。免疫染色和荧光原位杂交技术相结合(immuno-FISH)可用来分析单细胞或者单个染色体水平上的特定序列与其相关联的蛋白质空间结构的关系,拓展了荧光原位杂交技术的应用范围,并且可以作为染色质免疫共沉淀结合的测序技术(chromatinimmunoprecitation-sequencing,ChIPseq)或结合DNA微阵列技术(ChIP-chip)的一个互补方法。由于染色质免疫共沉淀结合的测序技术或DNA微阵列技术不能辨别处在细胞周期不同阶段的细胞,这样获得的数据只能代表一些基因不同表达模式的细胞群体或处于不同细胞周期的细胞群体所产生的平均值,而且这些技术也仅适用于已经测序或者已有芯片开发的物种。免疫染色结合的荧光原位杂交技术可以检测某一时期单细胞水平的某一DNA序列和与之相关联的蛋白质关系及其分布情况,这样有利于消除细胞间的差异性。传统的制片方法常采用卡诺固定液,其中的乙酸会破坏蛋白质的结构,所以在进行immunoFISH实验时通常采用4%的多聚甲醛来固定材料;由于荧光原位杂交中有加热的处理步骤,为避免蛋白质结构遭到破坏,需先使用相关抗体进行免疫染色并检测相关蛋白的分布情况,然后再进行荧光原位杂交。另外,当免疫染色与多色荧光原位杂交相结合时,蛋白质检测的信号不能太强以免干扰到DNA序列的检测,其最理想的结果就是DNA和蛋白质都能被检测到。Heng等利用多色荧光原位杂交和免疫染色相结合的方法研究了减数分裂前期的染色体和联会复合体之间的关系。immunoFISH还可用来检测特定区域的组蛋白修饰情况,如Zinner等利用三维技术分析了不同染色体组蛋白修饰的差异;Zhang等检测了rDNA重复序列区域组蛋白修饰的分布情况。免疫染色还可以和fiber-FISH相结合,检测被拉伸的染色质区域一些序列和相关蛋白的关系,大大提高了检测的分辨率。Jin等利用免疫染色和fiber-FISH检测了着丝粒序列和着丝粒蛋白的关系。近年来,immuno-FISH在研究表观遗传学、细胞分裂以及探讨染色质的结构与基因表达的关系等方面发挥了重要的作用。2.2qd-fish方法量子点(quantumdot,QD),又名半导体纳米晶体,具有独特的光化学和物理性质。自从成功地解决了量子点的水溶性和生物相容性的问题之后,量子点作为一种新型的荧光染料,已被广泛应用于免疫组化、细胞追踪、活体成像、流式细胞术和荧光原位杂交技术等。与传统有机荧光标记物相比,量子点具有很多优点,如量子点的激发光波长范围宽,而发射光波长范围窄,可以在一个激发光下观察到多个不同的量子点标记物;通过调节量子点的大小和组成,得到不同发射光谱的量子点,适用于多色标记;量子点的荧光强度强,不易发生光淬灭等。荧光原位杂交技术一般采用有机荧光染料来检测杂交信号,但是有机荧光基团容易发生淬灭,而且发射光波长范围宽,做多色杂交并在不同激发光下观察时,很容易串色。将量子点引入到荧光原位杂交体系中,不但可以解决这些问题,而且还大大提高了FISH检测的灵敏度。量子点-荧光原位杂交技术(QD-FISH)常通过两种方法来实现:一是间接标记法,即使用链霉亲和素-量子点偶联物来检测生物素标记的探针,目前市场上已有商业化的试剂盒出售;二是直接标记法,即使用量子点直接标记探针。尽管QD-FISH技术还不是很成熟,但还是有一些应用研究报道。Xiao和Barker首先将链霉亲合素偶联的量子点应用到检测人类中期染色体上的荧光原位杂交信号,并且证明量子点比传统的有机荧光染料更耐光漂,其中pH值对量子点荧光原位杂交的成功实施是非常关键的;Bentolila和Weiss进行了小鼠的量子点多色荧光原位杂交;Wu等使用合成的巯基乙酸量子点标记的DNA应用于大肠杆菌的荧光原位杂交;Ma等成功应用量子点来检测植物染色体的微卫星杂交信号;He等采用量子点标记的长链DNA片段实现了植物单拷贝基因的检测。随着QDFISH技术的改进与成熟,量子点作为一种新颖的荧光染料,将会进一步推动分子细胞遗传学的发展。2.3微流控芯片在线探针fishofpochip微流控芯片(microfluidicchip)技术是把医学、生物、化学等分析过程中的样品制备、反应、分离、检测等步骤集成到一块纳米级的芯片上,称为“芯片实验室”(labonachip)。整个过程可通过计算机操作,具有液体流动可控性、所需样品和试剂量较少、反应时间短等特点,而且还可以自动化进行大规模的样品分析。而传统的荧光原位杂交中探针的价格十分昂贵(尤其是医学诊断上需要的探针),且杂交的整个操作过程繁琐、耗时长,限制了FISH技术的广泛应用。将微流控芯片与荧光原位杂交相结合(FISHonmicrochip),可以避免这些缺点,并将杂交检测的时间缩短到传统荧光原位杂交所需时间的1/20(1小时基本可以完成整个操作),而试剂量仅为原来的1/10,大大降低了成本,并且可以自动化一次分析多个样本。此外,在微流控芯片的平台上,免疫染色-荧光原位杂交技术和量子点-荧光原位杂交技术都是可以实现的,并且还可以大大提高检测效率和灵敏度。3细胞生物学检测荧光原位杂交技术从诞生发展至今,经过不断的改进与完善,逐渐形成了快速、灵敏、动态、多样化等特点,在细胞遗传学、表观遗传学及分子生物学等领域发挥着重要的作用,为基因组研究提供了强大的工具。荧光原位杂交技术已广泛应用于染色体的识别、DNA序列的定位、物理图谱的构建、进化分析等研究。随着科技的不断进步,免疫染色与荧光原位杂交尤其是多色荧光原位杂交相结合,可以原位地单个细胞水平上检测各种染色体蛋白与DNA、RNA序列的关系;而DNA、RNA和蛋白质提取的方法,只是提供了细胞群体的一个平均水平。若要观察多种蛋白和多种DNA、RNA序列的关系,则需多种荧光基团标记物,同时对荧光显微镜的配置及性能要求也会提高,而且还要避免串色的影响。量子点原位杂交技术的发展很好的解决了这一问题,因为量子点激发光波长范围宽,而发射光波长范围窄,可以在一个激发光下观察到多个不同的量子点标记物,较适用于多色标记;而且量子点荧光强度强,不易发生光淬灭,可以进行低单拷贝序列的定位和长时间的活体检测。将量子点荧光原位杂交技术与免疫染色相结合,不但可以同时进行多种染色体蛋白与多种DNA、RNA序列的定位,而且还可实现对活体的实时检测。而微流控芯片与荧光原