黄土高原土壤中细菌群落结构的多样性分析

黄土高原土壤中细菌群落结构的多样性分析

在传统土壤生态系统中，微生物群落的多样性和结构通常通过分离和培养一般的生物化学特性或特定的表型来分析。这种方法存在很大的局限性,因为其研究结果很大程度上受样品采集、运输、保存和菌株分离等方法的影响,而且可培养的微生物只占全部微生物的1%左右。近年来,随着分子生物学的发展,可用于土壤微生物生态研究的新方法不断出现。以PCR(polymerasechainreaction)技术为主的分子生物学技术(RAPD、AFLP、FISH、SSR、DGGE/TGGE、ARDRA等)的广泛应用,为从分子水平揭示微生物多样性提供了新的方法,开拓了分子生物学与生态学的交叉领域。目前在环境微生物学中变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)是一种被普遍接受的用于微生物群落复杂性和行为研究的分子生物学方法。DGGE最早是一项用于DNA突变检测的电泳技术,近些年来已经被广泛应用于各种环境下微生物生态的研究中,如高热温泉、湖泊、海洋、土壤和根际等。黄土研究与深海沉积、极地冰芯研究曾并列为全球气候变化研究的3大支柱。黄土在世界上分布相当广泛,覆盖着约10%的地球陆地表面,黄土-古土壤-红黏土序列是晚新生代以来保留最完整的陆相地层,记录了晚新生代以来东亚古气候、古环境变化及古地磁等其他地质事件信息。目前,国内对黄土高原的研究主要侧重于将黄土和古土壤的物理和化学性质,如磁化率、Rb/Sr值、CIA、游离铁/全铁值、Fe/Mg值和反射率等作为揭示和重建东亚夏季风演变的指标,而对微生物与黄土和古土壤的关系了解较少。因此,借助黄土和古土壤中广泛存在的微生物群落来指示古气候的变化规律,为黄土高原的古气候演变研究提供新的思路。基于以上考虑,笔者采用PCR-DGGE方法对黄土高原不同深度及典型地区的土壤微生物群落结构变化进行初步研究,为黄土高原地区的气候演化和地质变迁研究提供有益补充。1土壤样品的采集黄土剖面中主要包括2种在颜色及结构上都具有很大差别的地层单元:1种为灰黄色黄土层,习惯上以L表示,质地较均一,无明显结构;另1种为红色古土壤层,以S表示,有明显土壤结构和土壤发生层次。在黄土层中又有弱风化的古土壤亚层,以LSS表示;同样,在古土壤层中也有黄土亚层的存在。本研究的5个地区黄土样品分别取自段家坡、洛川、董湾、渭南和西峰(图1),样品取自地面以下50cm处,各取2个平行土样混匀。5个地区样品编号分别为:DJ、LC、DW、WN、XF。其中,西峰采样点剖面地层为全新世古土壤S0、末次冰期黄土L1以及末次间冰期古土壤S1。从土壤表层开始每隔一段距离取样,用无菌铲子挖出,尽快装入已灭菌的离心管中,密封并编号。采样时用车载冰箱临时保存样品(提前准备好的冰袋使冰箱温度保持在0℃左右),采样结束后将土样放入-20℃冰箱冷藏。西峰样品编号分别为:XF0,XF30,XF60,XF90,XF150,XF200,…,XF1200,共26个样品。2材料和方法2.1s10e集料脱腐缓冲液:100mmol·L-1Tris,100mmol·L-1Na4P2O7,100mmol·L-1Na2EDTA,质量分数为1.0%PVP,100mmol·L-1NaCl,质量分数为4.0%脱脂奶粉,pH10.0。DNA提取缓冲液:100mmol·L-1Tris-HCl,100mmol·L-1EDTA,100mmol·L-1磷酸钠,1.5mol·L-1NaCl,质量分数为1%CTAB,质量分数为2%CaCl2,pH8.0。2.2sds-pcr法土壤样品的脱腐:在无菌操作下称取0.5g土壤样品,加入2.5mL脱腐剂,涡旋混匀,12000r·min-1离心5min,重复加入脱腐剂涡旋离心,至上清液颜色与洗涤缓冲液颜色无明显差异为止,于4℃保存样品。基因组总DNA的提取:于经过脱腐处理的土壤样品中加入1.35mLDNA提取缓冲液,涡旋振荡混匀,加入40μL蛋白酶K(2.5mg·mL-1),于摇床上225r·min-137℃震荡1h,加入160μL质量分数为20%SDS,轻摇混匀,于65℃水浴1h(每隔15min轻轻摇动1次)。6000r·min-1离心10min,转移上清液至新离心管中,向离心管中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),4℃下12000r·min-1离心10min,吸取上清液至新离心管中。加入0.6倍体积异丙醇,0.1倍体积3mol·L-1NaAc(pH5.2),混匀,置于4℃冰箱1h,沉淀DNA。从冰箱中取出样品,于4℃下10000r·min-1离心10min,弃上清液,用预冷的质量分数为70%乙醇洗涤2～3次,用无菌风吹干,溶于500μLTE缓冲液中。DNA的纯化:在DNA粗提液中加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),颠倒混匀,12000r·min-14℃离心20min,收集上清液,加入0.1倍体积3mol·L-1NaAc(pH5.2),颠倒混匀,加入0.6倍体积异丙醇4℃沉淀DNA1h,12000r·min-14℃离心20min,弃上清液,DNA沉淀用冷的质量分数为70%乙醇洗涤2次,冷冻干燥后溶于50μL灭菌TE缓冲液中。2.3扩增产物的结构PCR扩增对象为16SrDNA,引物采用通用引物,处于16SrDNA的V3区。上游引物F357为5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′;下游引物R518为5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′,GC发卡结构为5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCC-GCCCC-3′,扩增产物片段长约250bp。上述引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。PCR反应条件:预变性条件为94℃5min,循环为94℃45s,55℃1min,72℃45s,30个循环,最后在72℃下延伸10min,4℃保存。PCR反应产物用质量分数为1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测后-20℃保存备用。2.4pcr扩增产物的检测DGGE有2种电泳形式:垂直电泳和水平电泳。前者是指变性剂梯度和电泳方向垂直,后者是指变性剂梯度和电泳方向平行。在分析细菌群落的PCR扩增产物时,先利用垂直电泳确定变性剂梯度范围,再优化确定电泳所需时间,最后用水平电泳来对比分析不同的样品。采用时间间歇法确定最佳电泳时间。借助Bio-Rad公司的DcodeTM基因突变检测系统对PCR反应产物进行分析。扩增产物使用的变性剂梯度为40%～70%(100%变性剂为7mol·L-1尿素和40%去离子甲酰胺的混合物),所用凝胶为质量分数10%聚丙烯酰胺凝胶。2.5dage条带的平均表面粗糙度采用Shannon-Weiner指数(H′)进行微生物群落多样性分析,其计算公式为:H′=−∑i=1S(pilnpi)(1)pi=ni/N(2)式(1)和式(2)中,H′—Shannon-Weiner指数;S—每条泳带中条带总数;ni—单一条带i的峰面积;N—所有峰的总面积。对于DGGE来说,pi为特定条带亮度相对于所有条带总亮度的比率。采用QuantityOne软件(Bio-Rad)对DGGE条带进行分析。经过去除背景强度和设定噪声水平,软件自动获得一个密度剖面图,利用条带和条带间的相似度进行分析。3结果与讨论3.1a变性剂浓度黄土高原土壤中微生物具有数量低、微生物种类未知等特点,因此需要确定适宜的DGGE电泳条件,找到最佳变性剂梯度范围和最佳电泳时间。如图2所示,垂直胶变性梯度为0%到100%,DNA片段在垂直胶中染色后呈S形曲线。在胶的左侧,变性剂浓度低,DNA片段为双链形式,因此沿着电泳方向一直迁移。在胶的右侧,由于变性剂浓度高,DNA一进入胶就立刻发生了部分解链,因此迁移很慢。在胶的中间,DNA片段有不同程度的解链。当变性剂浓度临界于DNA片段最低解链区域时,DNA迁移速率有急剧变化。由QuantityOne软件计算得出适用于黄土高原土壤细菌多样性DGGE分析的变性梯度范围为40%～70%。对相同的黄土高原土壤细菌群落的PCR产物每隔1h加样,以确定最佳水平电泳时间。如图3所示,在电泳15h内,黄土高原土壤的PCR产物均未分离完全,而在18h后电泳时间过长,其最佳电泳时间确定为17h。3.2不同深度土壤条带菌群的特征KOIZUMI等和LLOBET-BROSSA等先后采用基于16SrDNA扩增的DGGE和基于逆转录16SrRNA扩增的DGGE方法研究不同深度土壤微生物群落的多样性。笔者采用类似的方法,细致分析了不同深度土壤中细菌群落结构特征。由图4可知,不同地质年代土壤样品的DGGE条带呈现2种细菌群落结构。在深度为0、30、60、90、150、200、250、300、450、800、850、1100、1150和1200cm处,土壤样品的条带数目、条带位置和条带信号的强弱十分相似,说明上述地质年代土壤中优势菌群结构相似;而在其他深度土壤中优势菌群发生了变化。这种微生物群落的规律性变化是由黄土高原的气候特征决定的。我国黄土高原气候受控于东亚季风活动,冬季盛行偏北的含有来自中、高纬度干冷空气的冬季风,夏季则盛行偏南的含有来自低纬度大洋暖湿空气的夏季风。黄土高原广泛发育的黄土-古土壤序列被认为是东亚冬夏季风交替作用的产物,其中黄土层代表了冬季风强盛而夏季风相对减弱的时期,气候干冷,粉尘堆积速率快,风化成壤作用较弱;古土壤层则代表了夏季风加强而冬季风减弱的时期,气候温暖潮湿,风化成壤作用强烈。因此,上述14个土壤样品所对应的地质年代气候相对温暖潮湿,土壤发育良好,土壤颗粒细而黏度大,蓄水能力强,生长的动、植物亦较多,它们的死体或经地壳演化埋入地下,或经微生物作用而腐烂分解,增加了土壤中微生物的营养。不同深度土壤中细菌群落的Shannon-Weiner指数变化如图5所示。图4中14个信号强的条带所对应深度土壤中细菌群落的Shannon-Weiner指数均高于1.6,这进一步证明了上述14个土壤样品所对应的地质年代黄土高原土壤微生物种群丰富。3.3土壤理化特性的差异通过对比5个地区土壤细菌DGGE图谱(图6)可知,各地区细菌群落结构变化很大,优势菌种不尽相同。总体来讲,靠近黄河流域水量丰富地区的微生物种类更多,如董湾和段家坡地区。从微生物群落相似性来看,西峰、洛川和渭南3地相似,原因在于3地的经、纬度相近,具有相似的气候和土壤特征。就Shannon-Weiner指数而言,西峰、董湾和渭南分别为2.745、2.739、2.707,3者接近;而洛川最低,为2.180;段家坡则为2.341。推测其原因可能是由于各地区的土壤理化特性存在差异。有研究发现细菌不能进入比它自身直径3倍还小的空隙中,细菌生物量与0.2～1.2μm直径的孔隙呈正相关,细菌主要存在于0.5～5.0μm大小的孔隙中,而真菌和放线菌生活在相对较大的空隙内。不同的土壤颗粒等级也可导致土壤微生物分布差异,黏粒含量高的土壤微生物多样性较高,细菌数量多,主要通过减少土壤微生物被土壤动物捕食和增加微生物获得营养的机会,以及增加土壤环境的多样性(如降低氧气浓度,为厌氧菌提供生长条件)等来实现,相反,在较大颗粒土壤中真菌数量相对增加。土壤微生物群落结构由于土壤颗粒大小的不同而差异很大。以上推测仍需要进一步研究证实。4不同深度土壤细菌群落组成的聚类分析DGGE是一种快速、可靠的检测微生物群落结构组成的分子生物学方法。笔者利用该技术对黄土高原不同地区和同一地区不同深度土壤细菌的群落结构组成进行了研究,揭示了黄土高原土