鲍曼不动杆菌脉冲场凝胶电泳实验步骤

鲍曼不动杆菌脉冲场凝胶电泳标准操作程序生物安全警告：所操作菌为条件致病菌，请按二级生物安全水平操作，转移和操作活菌时更要注意。处理大量菌株，请在生物安全柜中进行。以正确方式对接触培养物的塑料制品和玻璃制品进行消毒或丢弃。开始操作之前，请阅读所有指导。把所有接触过细胞悬液或凝胶块的塑料制品、玻璃制品、吸管、小铲等当作污染材料，按照实验室的生物要求丢弃或消毒。可重复使用的制胶模具须在清洗前消毒；可丢弃的制胶模具及胶带和用来把凝胶块从样品孔中推出的小片，应该用10%漂白剂消毒30分钟以上，然后清洗和重复使用。提前准备从检测培养基上挑取单菌落，接种于营养琼脂平板（或相当的培养基）上培养；用同一个接种针/环，穿刺或接种于小螺帽管中半固体培养基，以保证必要时重复检测同一个克隆。37°C培养14-18小时。第一天1、 打开水浴摇床（54C）、水浴箱（56C）。2、 用TE缓冲液（具体试剂配制方法见附件）制备1%SeakemGold：1%SDS琼脂糖，以配制25ml体积为例说明，方法如下：1） 准确称取0.25gSeaKemGoldagarose,放入250ml的蓝色瓶内。2） 加入22.5mlTE缓冲液，轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开。3）微松瓶盖，将玻璃瓶放于微波炉内高火加热30秒，取出轻柔摇荡，再次加热30秒，重复操作直至琼脂彻底溶解（无颗粒物、悬浮物，透光均一，无明显异常折光，无气泡）。4） 将溶解的SeaKemGoldagarose放入56C（55-60C均可）水浴箱内全少15分钟，再加入预热到56C的10%SDS溶液2.5ml，置于56C水浴箱备用。3、 在Falcon2054管（或其他相当的管）上标记样品名称和空白对照；在1.5ml微量离心管上标记好对应样品的名称。4、 在Falcon2054管中分别加入约2ml细胞悬浊液CSB（配制方法见附件）。注：使用测定细菌浓度的容器不同加入CSB的量也不同。5、 用CSB湿润棉签，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中。通过加入CSB稀释或增加菌量提高浓度，调整细胞悬液浓度至指定范围。用比浊仪（bioMerieuxVitekcolorimeter）测其浓度，并调整浓度至3.0-3.5麦氏单位。注：在3.0〜3.5该范围内细菌的浓度都可得到较满意的实验结果，但过大的浓度差距会造成同一块胶上的条带亮度差异，影响条带的识别。6、 取400闫细菌悬浊液于相应的1.5ml微量离心管中，置于37°C水浴中孵育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备完毕。7、 从水浴箱中取出微量离心管，每管加入20M蛋白酶K（储存液浓度20mg/ml）混匀，使其终浓度为0.5mg/ml，蛋白酶K置于冰上备用。注：蛋白酶K的终浓度是指在加入400M琼脂后的浓度。8、加入400M的1%SeakemGold：1%SDS到上述装有400M细菌悬液的微量离心管内，用枪头轻轻混匀，避免有气泡产生。（此时1%SeakemGold：1%SDS需置于56C水浴中）注：没有用完的SeakemGoldagarose可放于室温，并可重复使用1-2次。再溶时，加热时间缩短到每10-15秒一次，直至完全溶解。9、 迅速将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。为节省时间也可以在4C下凝固5分钟。10、 记录好模具内对应样品的名称。细菌的裂解1、 在50ml离心管上做好样品标记。注：相同菌株的胶条可以同时放于同一个管中裂解，最多不要超过4条。2、 配制细胞裂解液CLB（配制方法见附件），然后向每5ml细胞裂解液加入25M蛋白酶K（20mg/ml），使其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。注：蛋白酶K要置于冰上，配制好的蛋白酶K/CLB混合液也要置于冰上。建议配制总量后进行分装。3、 每个离心管加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。4、 如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。打开可重复利用模具，用小铲将胶块推入上述裂解混合液中。保证胶块在液面下，而不在管壁上。注：剩余的菌液以及其它使用过的器具应丢弃并消毒。可重复利用模具需要浸于泡腾片消毒液中15分钟，然后清洗干净。5、 将离心管放在54°C水浴摇床中孵育2小时，转速约130转/分钟。确认水浴箱内液面高于离心管内裂解混合液的液面。6、 将纯水和TE放在50C水浴箱中预热。清洗胶块1、 调低水浴摇床的温度至50C。2、 从水浴摇床中拿出装有胶条的离心管，盖上滤盖，轻轻倒掉CLB，在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。注：可将离心管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排净。随后的操作中也如此。3、 每管中加入10ml预热的TYPEONEWATER。确保胶块在液面下而不在管壁或注：TYPEONEWATER是水质达到18.2M欧的纯水经高压灭菌后得到的，清洗胶块以及配置TE缓冲液时均需使用TYPEONEWATERo4、 放回50C水浴摇床中，转速约130转/分钟，摇10分钟。5、 倒掉水，用TYPEONEWATER再洗一次。6、 倒掉水，加入10ml预热的TE，在50C的水浴摇床中摇15分钟。7、 倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10-15分钟。8、 倒掉丁£，加入10mlTE，放在4C冰箱保存备用。注：要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。第二天胶块内DNA的酶切1、 在1.5ml离心管上标记好相应的样品及H9812的名称。注：H9812为国际标准株，其Xba1酶切片断可用于分子量标准2、 按照下面的比例配制缓冲液M的缓冲体系，并混匀。试剂M/胶块M/11胶块纯水160M1760mBufferM20闫220闫BSA20闫220闫总体积200M2200m注：缓冲液要置于冰上。不同试剂供应商，相同试剂供应商的不同酶切缓冲液是不通用的，所以应根据产品说明来配制缓冲体系，这里以TaKaRa为例。3、 在每个1.5ml微量离心管中加入200闫缓冲液。4、 小心地从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。5、 用刀片切下约2mm宽的胶块放入1.5ml微量离心管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。6、 将试管放在37°C水浴中孵育10-15分钟。7、 在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下比例配制酶切反应体系，混匀。试剂M/胶块M/11胶块纯水157m1727mBufferM20闫220mBSA20闫220mApaI(15U/M)3闫33闫总体积200m2200m注：将酶置于冰上，用后立即放在一20C保存。8、 用枪头吸出缓冲液M，避免损伤胶块。9、 每管加入200闫混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的下面。10、 在37C水浴中孵育至少2小时。加样1、 打开水浴箱，温度调至55-60C。2、 配制2200ml的0.5XTBE。3、 用0.5XTBE配制1%SeaKemGold（SKG）胶。14cm宽电泳胶框（10-15加样孔）：1.0gSKG胶溶于100ml0.5XTBE中;21cm宽电泳胶框（N15加样孔）：1.5gSKG胶溶于150ml0.5XTBE中。4、熔化时，微波加热60秒，混合；每隔15-30秒重复一次，直到胶完全熔化。放在55-60°C水浴箱备用（温度至少平衡30分钟以后使用）。5、 调整梳子高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使其水平。6、 从37C水浴中取出胶块，平衡到室温。7、 用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。8、 每管加入200闫0.5XTBE，室温平衡3分钟。9、 把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。把标准菌株H9812上样在第1、5、10个齿上（10齿梳子）或第1、5、10、15个齿上（15齿梳子）。10、 用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风十约3分钟。11、 把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入100ml熔化的在55C—60C平衡的1%SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟。10、记录加样顺序。电泳条件1、 确保电泳槽是水平的。如果不水平，调整槽底部的旋钮。注：不要触碰电极。2、 加入2-2.2L0.5XTBE，关上盖子。3、 打开主机和泵的开关，确保泵设在一70（这时缓冲液的流速约1L/分钟）和缓冲液在管道中正常循环。4、 打开冷凝机，确保预设温度在14C（缓冲液达到该温度通常约需要20分钟）。5、 打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。6、 设置电泳参数。Initialswitchtime=5.0secondsFinalswitchtime=20.0seconds，线性，电压6V/cm。电泳时间为19小时启动“StartRun”第三天图像的获取1、 结束电泳：关机顺序为：冷凝机一泵一主机。2、 取出胶，放在盛放400mlEB溶液的托盘内。注：EB储存液浓度为10mg/ml，1：10,000稀释，即在400ml水中加入40闫储存液EB是强致畸剂。储存在棕色瓶中的EB稀释液可以用10次左右。废弃的EB溶液应妥善处理。可选用毒性小的GelRed染剂做代替。3、 将托盘放在摇床上摇25-30分钟。4、 放掉电泳槽中的TBE,用2L纯水清洗电泳