迷走神经刺激后激活的丘脑室旁核和下丘脑室旁核中含谷氨酸能神经元的研究

迷走神经刺激后激活的丘脑室旁核和下丘脑室旁核中含谷氨酸能神经元的研究

20世纪30年代，人们意识到意识到eeg被诱导是因为大脑激活（vns），这会导致大脑激活的变化。当前,欧美国家已经普遍应用该技术;全世界已有超过15000癫疒间患者接受了迷走神经刺激疗法。初步结果显示,VNS可以降低癫疒间发作频率,减轻癫疒间发作程度。但是此法的机理尚不明了。在前期实验中,笔者观察到VNS后在丘脑室旁核(paraventricularnucleusofthalamus,PV)、下丘脑室旁核(paraventricularnucleusofhypothalamus,PVN)内的Fos阳性细胞数高于正常组,提示PV、PVN是VNS的作用核团,VNS激活了PV、PVN的神经元。谷氨酸(Glutamate,Glu)是哺乳动物中枢神经系统中的一种兴奋性神经递质,在丘脑大量存在。本研究利用Fos和Glu免疫组化双标法,观察VNS后PV、PVN是否存在Fos和Glu的双标细胞,来验证VNS后激活的PV、PVN的神经元是否含谷氨酸能神经元。1材料和方法1.1免疫组化抗体健康成年SD大鼠6只,体重190～220g,南京医科大学实验动物中心提供。试剂焦油紫(美国Sigma公司),兔抗Fos蛋白抗体(美国Sigma公司),小鼠抗谷氨酸抗体(美国Sigma公司),生物素化羊抗兔IgG(武汉博士德公司),生物素化羊抗小鼠IgG(武汉博士德公司),SABC(武汉博士德公司),蓝色DAB-H2O2(武汉博士德公司),黄色DAB-H2O2(武汉博士德公司)。1.2方法1.2.1神经电刺激试验实验前动物在安静、温暖的环境中饲养24h。VNS组经乙醚吸入结合戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉,仰卧固定,颈部正中切口,暴露左侧颈动脉鞘,分离迷走神经干;将自制电极置于神经干两端,电极外接DCQ-3型电刺激仪。刺激参数:频率50Hz、电压4.5V、波宽1ms;刺激时间30s、间歇5min,重复10次。1.2.2fos免疫组化动物经处理后存活2h,继之开胸,经左心室插管,100ml生理盐水冲洗后,冷4%多聚甲醛灌注。取脑,视交叉向后1mm切取含PV、PVN部位组织,切成2mm厚,置4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)中后固定12h。常规脱水、石蜡包埋、切片,片厚5μm,隔20取4,分别行Fos免疫组化染色、对照实验和Nissl染色定位;取Fos显色理想部位行Glu免疫组化染色。1.2.3小鼠抗能谱显色法检测igg水平固原螯虾体内氨基酸切片常规脱蜡至水,入含0.3%TritonX-100和3%H2O2中10min,pH6.0柠檬酸缓冲液热修复抗原,BSA室温10min,依次入兔抗Fos蛋白抗体(1∶2000)1h(37℃),生物素化羊抗兔IgG10min,SABC20min,蓝色DAB-H2O2显色。镜下控制显色,蒸馏水终止反应。0.02mol/L的PBS充分漂洗后,BSA室温10min,入小鼠抗谷氨酸抗体(1∶2000)2h(37℃),生物素化羊抗小鼠IgG10min,SABC20min,黄色DAB-H2O2显色。镜下控制显色,蒸馏水终止反应。上述各步骤间均用0.02mol/L的PBS充分漂洗3次,每次2min。脱水,透明,中性树胶封片,观察。对照实验:以兔、小鼠正常血清代替一抗孵育切片。1.2.4nissl染色切片常规脱蜡至水,1%焦油紫溶液,室温30℃,95%酒精分化数秒,脱水,透明,中性树胶封片,观察。1.3glu/fos双标细胞计数置光学显微镜10×10倍观察定位核团,在40×10倍镜下,用Leica图像分析系统分别计数Glu单标细胞、Fos单标细胞和Glu/Fos双标细胞(以0.02mm2为单位面积计数)。计算方法同Fos。1.4统计方法数据用均数±标准差(x±s)表示,P<0.05为结果有统计学意义。2结果2.1拾遗织物色散在pv、pvn光镜下观察,在双标染色切片上显示三种阳性细胞:Fos单标阳性细胞的细胞核呈褐色,多为圆形或卵圆形,散在分布于PV、PVN;Glu单标阳性细胞的细胞浆呈黄色,细胞核不着色,散在分布于PV、PVN;Fos和Glu双标细胞的细胞核呈深褐色,细胞浆呈黄色,零星分布于PV、PVN(表1,图1、2,封三)。2.2nissl染色神经元胞体为蓝色,胶质细胞为淡蓝色,背景无色。2.3比较实验以正常兔、小鼠血清代替一抗孵育切片,为阴性。3vns激活glu能神经元的作用目前公认的VNS抗疒间机制假说为“直接联系理论”和“递质学说”。“直接联系理论”认为经由迷走神经传入的电刺激信号通过孤束核及其他相关结构,如丘脑、杏仁核、海马、下丘脑、岛叶皮质等,这可能引起了同步与非同步的脑电活动,从而引起脑电图的间隔变化,使癫疒间发作阈值升高。在前期实验中,笔者利用Fos阳性细胞作为神经元被激活的标志,观察到VNS激活了PV、PVN的神经元。“递质学说”提出VNS通过改变递质水平发挥抗疒间作用。神经递质的变化,包括增加抑制性递质和减少兴奋性递质。既往的研究主要集中在γ-氨基丁酸、去甲肾上腺素和单胺类递质等抑制性递质。但对兴奋性递质,特别是Glu的报道较少。Glu作为脑内的一种神经递质,在癫疒间发作中起着重要的作用,其作用主要通过两类受体介导:离子型受体和代谢型受体。Glu的解毒主要经过神经元的重摄取和神经胶质细胞的摄取。本实验参数的迷走神经刺激产生脑电去同步,发挥了抑疒间作用;且PV、PVN既是VNS的活化区域,也是癫疒间的敏感区域;因此在PV、PVN,单纯VNS引起的变化与癫疒间的起源和调节有关。通过Fos/Glu的双标实验,笔者观察到VNS后在PV、PVN处,可见Fos/Glu双标细胞,说明Glu能神经元被VNS激活,这些激活的Glu能神经元在VNS抑癫疒间的机制中发挥着重要的作用。Fos/Glu双标细胞仅占Glu阳性细胞总数的33%、33%,说明并不是所有的Glu能神经元都能被VNS激活;Fos/Glu双标细胞仅占被激活的细胞总数的29%、35%,说明VNS还激活了其他细胞,它们可能共同对PV、PVN内的Glu能神经元进行调控。结合上述的研究内容,笔者推测VNS抑癫疒间的机制。第一,VNS激活了Glu能神经元,但同时也激活了其他的一些物质如胶质细胞。激活的神经元和神经胶质细胞通过加强对细胞间隙内Glu的重摄取,降低胞外Glu的浓度。第二,VNS可能降低部分离子型Glu受体的密度,减少突触前Glu与突触后膜的受体结合,使Ca2+的内流减少,引起Glu的胞内堆积,从而减少Glu向胞外的释放。第三,VNS可能激活部分代谢型Glu受体,致cAMP介导的突触前电压依赖性钙通道磷酸化的减少,从而减少Ca2+的内流,抑制Glu的释放,突触后膜上的代谢型Glu受体激活后也可通过cAMP途径减轻兴奋性毒性损害。第四,被VNS激活的Glu能神经元可能起着中间神经元的作用,兴奋抑制性突触,升高抑制性递质和受体水平,对Glu的