crh转录调控及中药对其调节的研究进展

crh转录调控及中药对其调节的研究进展

黄海-肾上腺皮质（hpa）轴是身体在激过程中激活的一个重要神经物理学系统。下丘脑的促肾上腺激素释放激素(CRH)在HPA轴的功能调节中具有重要地位。下丘脑室旁核小细胞部的CRH神经元能接受和整合多种兴奋性和抑制性传入信号,最终决定是否启动CRH的合成和释放。由于CRH是调节HPA轴功能的关键位点之一,因此CRH基因转录调控的分子机制研究显得非常重要,已有大量的研究报道。CRH转录调控的研究也能为设计、开发调节CRH表达的药物提供基础。CRH是中医药研究中的明星分子,之所以这样说,是因为迄今已有大量的研究显示各种治疗法则的中药(补肾药、疏肝药等)均能调节CRH的基因表达,为深入推进中医药对CRH基因表达调节的研究,本文对CRH的转录调控及中药对其调节的研究进展进行了综述。一、crh1和crh-c3表达CRH基因由两个外显子和1个内含子组成,人类的CRH基因位于第8号染色体长臂。CRH基因并不直接产生成熟的CRH,而是由CRH前体经酶切而成,人类的CRH为41个氨基酸的多肽,来自于一个196个氨基酸的前体。CRH基因的核苷酸序列在所有脊椎动物(包括鱼、蟾蜍、鸡、大小鼠、羊等)高度保守。CRH有两型受体,CRH-R1和CRH-R2,其中CRH-R2在啮齿类动物及人类有两个剪切变异子CRH-R2α和CRH-R2β,在人类还发现了第三个剪切变异子CRH-R2γ。CRH是CRH-R1的强效激动剂,CRH对垂体的作用即是通过CRH-R1介导。已经发现多种CRH样多肽,包括urocortin、urocortinⅡ或称为stresscopin-like肽、urocortinⅢ或称为stresscopin肽。urocortin对两型受体均有作用,urocortinⅡ、urocortinⅢ则是CRH-R2的特异性激动剂。CRH除了在下丘脑室旁核表达外,已发现在大脑皮层、炎症组织、胎盘、心脏等均有表达,提示其可能参与广泛的生理病理过程。在发育过程中,CRH在胚胎的一定时期后开始表达,如小鼠在其胚胎第13.5天,下丘脑室旁核、巴林顿核、橄榄复合体等开始表达,而在大脑皮质的表达,小鼠出生时才能检测到。CRH的两型受体也广泛表达,但检测发现在垂体CRH-R1mRNA比CRH-R2mRNA表达高100倍,显示了受体表达与CRH功能发挥的适配。二、调整crh基因转移的主要信号1.磷酸化creb激活后crh的转录cAMP-PKA-pCREB/TORC信号通路是下丘脑CRH神经元,甚至也是其他组织激活CRH转录的主要细胞内信号通路。Adler等在小鼠前叶垂体细胞系At-T20观察到,采用腺苷酸环化酶激动剂forskolin能剂量依赖和特异地升高CRHmRNA表达及CRH多肽分泌。后有研究发现,forskolin和cAMP类似物8-bromo-cAMP激活蛋白激酶A(PKA);CRH基因转录起始位点上游-238～-180核苷酸处为cAMP反应元件,为该通路激活CRH所必需的基因序列。受cAMP激活后的PKA,进一步磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(pCREB),该蛋白进而和CRH基因的cAMP反应元件结合,但研究也发现仅磷酸化CREB并不能使CRH转录,在神经元细胞系以及原代神经元培养物中,给予蛋白激酶C的激动剂,虽能导致CREB磷酸化,但不能激活CRH转录;同时,大鼠实验也发现在下丘脑室旁核显微注射8-bromo-cAMP、phorbolester12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA,蛋白激酶C激动剂),8-bromo-cAMP能激活CRH转录而后者不能。虽然CREB单独不能激活CRH,但却为cAMP激活CRH转录所必需的分子,因为CREB的显性阴性突变(Dominantnegativemutation)阻断了cAMP对CRH的转录激活作用。由此有研究推测cAMP可能还激活了其他蛋白,作为CREB转录激活CRH的共激活分子,后来发现该分子即是transducerofregulatedCREB(TORC)。TORC家族现已发现三个成员TORC1,2,3,在CRH转录中TORC2可能最为重要。基础状态下,TORC位于胞浆,以磷酸化无活性形式与折叠蛋白14-3-3结合,接受cAMP-PKA信号后,TORC快速进入细胞核,与磷酸化CREB二聚体结合,增强CREB与TATA结合蛋白相关因子(TAF4)的相互作用,TORC对于cAMP导致的CRH转录也是必要但非充分条件,不能单独发挥作用,因为采用siRNA干扰TORC表达阻断了forskolin引起的CRH转录。最近研究发现TORC在应激引起的CRH转录激活中发挥了作用。2.糖皮质受体对crh基因转录的影响糖皮质激素是下丘脑室旁核CRH转录的抑制剂,但随实验条件其作用或有不同。在双侧肾上腺切除的大鼠,下丘脑室旁核CRH表达显著升高,给予糖皮质激素又能使之恢复,但肾上腺切除动物在一段时间后,其下丘脑CRHmRNA能回到基础水平。糖皮质激素受体缺失鼠下丘脑正中隆起的CRH比野生型高5倍。但研究表明,糖皮质激素并不是在所有情况下均抑制CRH转录。如有研究在应激大鼠,尽管血浆皮质酮水平很高,CRH仍显著升高。糖皮质激素对CRH表达的抑制效应也显示具有部位特异性,如对杏仁中央核、终纹床核及视上核的CRHmRNA表达则没有抑制作用,甚或上调其表达。据报道,糖皮质激素能刺激胎盘CRHmRNA表达和分泌。机制研究显示糖皮质激素受体为糖皮质激素抑制CRH基因转录所必需的。在CRH基因启动子区发现了几个糖皮质激素受体DNA结合元件,但删除或突变该序列,并不能阻断糖皮质激素对CRH转录的抑制作用,因此推测糖皮质激素受体可能通过蛋白相互作用(如同CREB相互作用)而抑制CRH转录;但也有研究指出大量的糖皮质激素受体可能仍可以和CRH基因启动子区的糖皮质激素反应元件结合。有研究在CHO-K1细胞共转染人雌激素受体、small-ubiquitinrelatedmodifier(SUMO1)基因以及CRH启动子报告基因,结果发现雌二醇能显著提高CRH启动子活性,且能被雌激素受体抑制剂ICI182780阻断。研究显示CRH启动子区没有发现雌激素反应元件,雌二醇上调CRH表达可能通过雌激素受体及cAMP反应元件的相互作用。体内研究也显示长期雌激素治疗显著升高杏仁核中央核的CRHmRNA表达。雌激素对CRH表达的调节作用也呈现细胞特异性,如对胎盘细胞CRHmRNA表达呈现抑制作用。雄激素受体对CRH转录的作用,近期也有研究显示雄激素受体和CRH在人下丘脑室旁核共定位;对神经母细胞瘤细胞,采用睾酮处理时,睾酮通过激活的雄激素受体,进而结合到CRH基因上游的雄激素反应元件(ARE),抑制CRH启动子活性。研究也发现了多种其他信号参与CRH基因转录调节。如孕酮受体信号、维甲酸RAR-alpha受体信号、脂多糖、白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α是CRH基因表达较肯定的激动剂,但这些多肽就分子量而言,均不能穿透血脑屏障,其具体机制还在研究之中,可参见相关综述。3.crh基因转录调控室旁核小细胞部CRH神经元能接受延髓A2、A6去甲肾上腺素能、C1-3肾上腺素能细胞群的支配,而A1去甲肾上腺素能细胞群主要支配室旁核的巨细胞部。研究表明去甲肾上腺素直接显微注射至清醒大鼠室旁核能刺激CRHmRNA,采用CRH基因探针原位杂交也发现此结果。介导去甲肾上腺素该作用的受体可能是α1B-肾上腺能受体。目前对于肾上腺素调节CRH表达的研究还较少。给清醒大鼠的室旁核显微注射乙酰胆碱升高CRHmRNA的表达,该作用可能通过毒蕈碱型受体,而非阿托品型受体介导。来自终纹床核或室旁核内的γ-氨基丁酸(GABA)能神经元对HPA轴活性具有抑制作用,注射GABA-A通道配体能抑制急性应激诱导的ACTH释放。GABA降解阻断剂gamma-vinyl-GABA(VGB)被用来治疗成年和未成年癫痫。在VGB治疗组,室旁核CRHmRNA下调,但VGB对其他边缘系统未有影响,显示GABA信号对下丘脑CRH表达调节的特异性。研究发现serotonin(5-HT)可以通过激活5-HT1A,5-HT1B,5-HT2A或5-HT2C多种受体升高室旁核CRH表达。CRH神经元也被含神经肽的神经元支配。大部分神经肽对CRH基因表达的详细作用和机制还不很清楚。对CRH基因转录可能具有激活作用的神经肽包括神经肽Y、血管紧张素Ⅱ、胆囊收缩素、脑啡肽、激活素、食欲素、垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP);可能具有抑制作用的神经肽包括β-内啡肽、强啡肽、P物质、生长抑素、甘丙肽。CRH转录调控的机制研究取得了重要进展,但它的一些细节机制;各种不同信号之间的相互作用,尤其是中枢递质对CRH转录的调控机制都还需要深入的研究,在此回顾CRH转录调控机制,主要目的是这个机制展示出来的复杂性,可以提供一个研究中药调节CRH基因表达的初步指引。三、增强平台药对脏器crh表达的影响中药对CRHmRNA表达的调节最早见于钟历勇等于1997年的报道,研究采用皮质酮注射造成HPA轴抑制模型,此模型下丘脑CRHmRNA表达下降,补肾阳复方右归饮能提高CRHmRNA的表达,而健脾复方四君子汤、活血复方桃红四物汤则无此作用。蔡定芳等发现该模型大鼠下丘脑CRH神经元减少,而补肾药淫羊藿能拮抗其减少,但没有直接检测CRHmRNA的表达。此后有较多研究报道补肾药物能提高此模型下丘脑CRH的含量或表达。并且在其他肾阳虚模型和有关疾病模型,也有报道补肾药能提高CRH含量或表达。如有研究采用腺嘌呤造成肾虚多尿大鼠模型,金锁固精丸可显著提高肾虚多尿大鼠血中CRH含量。毛昌淳等在哮喘大鼠模型,发现补肾阴、补肾阳、阴阳双补方均能不同程度的提高下丘脑CRH表达,并以阴阳双补法最为明显;赵福东等在哮喘模型发现补肾药淫羊藿对下丘脑CRHmRNA表达确有提高作用。对于肾阴虚模型,CRH多肽含量或mRNA常升高,滋肾阴方有降低作用,如蔡定芳等采用单钠谷氨酸造成HPA轴功能亢进,此模型下丘脑CRH含量升高,滋阴复方左归丸能下降其含量。在自然衰老大鼠,姚建平等发现,老年大鼠和青年大鼠比较下丘脑CRHmRNA表达升高,右归饮使之降低;该课题组还发现左归丸和右归丸均能使杏仁核CRH多肽表达下降。补肾药对下丘脑CRH表达调节效应差异较大,这可能和研究所采用的模型有关,不同的模型提供了一个截然不同的机体背景。也应注意,不仅补肾药,也有其他的药物使下丘脑CRH表达升高,如日本的Tozawa等发现柴苓汤、朱建华等发现雷公藤甲素能升高下丘脑CRH含量。中药对抑郁症模型的CRH表达的调节作用有较多文献报道。如有研究采用束缚应激模型,下丘脑CRH含量升高,加味四逆散使之降低;在围绝经期大鼠抑郁模型,给予补肾解郁清心方;在不可预知情绪应激模型,给予电针刺激;在嗅球损伤抑郁模型,给予枳术宽中胶囊;在慢性应激结合孤养模型,给予半夏厚朴汤,药物均能使升高的CRHmRNA表达或多肽含量下降。李云鹏等大鼠脾胃湿热证模型,发现大鼠血清CRH上升,而三仁汤降低其含量,作者也发现动物行为发生改变,不排除造模导致了抑郁。刘汶等检测肝气郁结证患者的血清CRH含量,发现柴胡疏肝散能降低血清中升高的CRH。中药调节抑郁模型的CRH表达文献还有很多,这里不可能全部罗列,通过对文献的综合分析,相关中药均能降低CRHmRNA表达或多肽含量。四、对中药中crh基因表达的研究CRHmRNA的表达量由基因转录速率和降解速率共同决定。如前所述,仅就CRH转录调控这一方面而言,即涉及多种信号通路、多种分子在基因调节区附近的复杂作用,已经进行的中药调节CRH基因表达的实验研究,均仅仅观察CRH多肽含量或CRHmRNA表达量,论证的强度显得不够,只有将引起CRH转录的整个信号流有所研究,对CRH降解的方面也有所研究,才能形成一个证据的链条,如此,我们方可以更有信心的下结论。中药调节CRH基因表达研究的第二个主要问题是,通过大量文献我们相信中药中的确存在调节CRH表达的药物,但无论是补肾药,还是疏肝解郁药物,其治则和组方变化均较大,药物进入体内,仍然是通过其化学成分发挥作用,不能长期重复进行复方药效、药理的研究,