银杏叶复方对大鼠脑神经生长因子受体表达的影响

银杏叶复方对大鼠脑神经生长因子受体表达的影响

干预大脑的缺血性（ciri）可能会导致严重的精神障碍。目前，许多中药剂的研究用于治疗银杏叶、黄鼠尾、丹参、葛根素、红花等mi科。然而，关于中药的药物研究很少。神经生长因子是一种最早发现并已得到深入研究的神经营养因子,它可通过不同途径来保护缺血再灌注损伤的神经元,并已得到证实。本研究设计把下丘脑视上核、室旁核表达的神经生长因子受体(NG-FR)作为观察指标,研究银杏叶复方对CIRI大鼠的神经保护作用,揭示该中药复方可能的神经保护机制,为银杏叶复方治疗CIRI提供理论依据。1材料和方法1.1动物饲料动物中心成年健康Sprage-Dawley大鼠21只,雌雄不拘,体重(250±50)g,购自浙江中医药大学动物中心。喂以平衡饲料,自由进水。随机分为假手术组(sham组)7只,脑缺血再灌注损伤组(I/R组)7只和银杏叶复方治疗组(GBE组)7只。1.2皮肤保水性动物模型采用pulsinelli四血管(4VO)法建立急性全脑缺血再灌注损伤(globalcerebralischemiareperfusioninjury,GCIRI)动物模型。用2%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射麻醉,切开大鼠颈部背侧皮肤,暴露第一颈椎双侧翼小孔,电凝双侧椎动脉,局部缝合皮肤;改仰卧,颈正中切口切开皮肤,游离双侧颈总动脉后钳闭10min,造成弥漫性全脑缺血,30min后去除动脉夹使其再灌注60min,缝合皮肤。Sham组除不电凝双侧椎动脉和夹闭颈总动脉外,余操作同I/R组和GBE组。成模标准:造模后24h,钳闭双侧颈总动脉,动物昏迷并双侧虹膜变白。符合上述标准者入选,否则剔除。1.3药物、药品、制剂银杏叶复方由银杏30g,红花12g,黄芪15g,当归12g,桃仁12g,丹参30g,葛根15g,甘草10g,法半夏12g,川芎9g组成。该药购自浙江省中医院中药房,加水300mL,煎成每毫升含4g生药的制剂备用。NGFR免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。1.4给药方法GBE组大鼠从造模前1月至成模后1周,按4g/kg银杏叶复方生药剂量每日灌胃给药,sham组和I/R组灌服等量生理盐水。1.5大、大鼠脑冠状面反复电泳组化动物成模后1周,2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,开胸暴露心脏,自左心室插管到主动脉快速灌注生理盐水冲洗,剪开右心耳,至血色清淡,然后用4%多聚甲醛(PBS)500～1000mL灌注约30min,先快后慢。断头取脑,标本置入30%PBS溶液中,固定至脑下沉后,行冰冻切片。参照包新民大鼠脑立体定位图谱选取大鼠下丘脑B-0.8～-5.2段进行脑冠状面连续冰冻切片,片厚20μm,每隔4片取1片,每例选相邻切片6张,共取5套切片,按试剂盒说明进行NGFR免疫组化染色。阴性对照组用PBS磷酸盐缓冲液代替一抗。1.6细胞密度和脑片密度的测定电镜下分别观察3组动物在视束外侧区下丘脑视上核和穹隆与第三脑室间的下丘脑室旁核内的NGFR阳性细胞,并对每例每套脑切片的下丘脑区视上核和室旁核在200μm×200μm的方格测微尺内计数在方格内形态清楚的NGFR阳性细胞数,并以单位面积内阳性细胞数计算细胞密度值。1.7统计处理使用SPSS11.5软件进行统计学分析。所得数据以均数表示,组间差别比较采用t检验,以P<0.05为具有统计学意义。2组fr阳性细胞密度的比较NGFR阳性细胞的形态:NGFR阳性细胞为胞浆内含棕色颗粒的细胞,细胞为椭圆形和梭形,胞体、神经纤维及纤维终末均可染色。NGFR阳性细胞的密度:在GBE组,下丘脑视上核与室旁核的NGFR阳性细胞密度最大,I/R组次之,sham组最少,有关3组NGFR细胞密度的对比详见图1～4。Sham组与I/R组视上核、室旁核NGFR阳性细胞密度差异有显著性(P<0.05);Sham组与GBE组NGFR密度差异有高度显著性(P<0.01);I/R组和GBE组NGFR密度差异有高度显著性(P<0.01),详见表1。3外源性药物治疗cii的理论依据神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)是发现最早、最典型、研究最多的一种神经营养因子。而神经生长因子受体(NGFR)有两种类型,一种是低亲和力受体(LNG-FR,p75),其不起介导信号作用,只对信号传递起协同作用;另一种是高亲和力受体(HNGFR,p140),包括TrkA、TrkB、TrkC,TrkA是NGF的功能受体。NGF只有与TrkA结合并在p75的协同作用下才能发挥正常的生物学效应。NGFR在轴突的生长和细胞的存活方面起着非常重要的作用,并能促进损伤后神经元再生。脑缺血再灌注损伤后“级联反应”产生的各种病理毒素,通过激活内源性神经保护机制,NGFR效应神经元表达NGFR增加而产生抗缺血损伤作用。但内源性NGFR表达时程很短,表达水平有限,难以对受损神经元起到全面而持久的保护作用,脑细胞最终会死亡。这点在本实验中也得到证实,I/R组大鼠的下丘脑视上核/室旁核的NGFR表达较Sham组大鼠增加,但增加幅度有限,远低于GBE组增加水平。因此外源性药物干预可阻断缺血后级联反应,下调促凋亡基因、上调脑源性神经营养因子(BNDF)及NGF等神经因子的表达,从而起到神经保护作用,此即为各种药物治疗CIRI的理论依据。目前已有多种中药应用于治疗CIRI的基础与临床研究中。其中,银杏叶提取物研究最为广泛与深入。银杏叶提取物(Ginkgobilobaextract)的主要有效成分为银杏黄酮类(大于24%)和银杏内酯类(大于6%)。其治疗脑缺血再灌注损伤的机理有以下几方面:(1)改善脑微循环及代谢,减轻脑水肿;(2)抑制钙超载,扩张脑血管;(3)银杏黄酮具有较强的清除自由基和抗氧化作用;(4)银杏内酯具有高效的抗血小板活化因子作用;(5)抗感染作用;(6)调节神经递质和受体。川芎嗪可通过扩张血管、抑制血小板聚集、改善微循环、抑制缺血区血管内皮细胞与白细胞的黏附等作用抗神经细胞凋亡。黄芪能改善血液流变学,抗氧化与氧自由基,抑制EAA的释放与防止钙超载,降低NO与NOS的活性,抑制HSP70表达等而产生抗CIRI作用。丹参可从清除氧自由基、保护线粒体、改善能量代谢、减轻钙超负荷、调整TXA2/PGI2平衡等方面降低神经细胞损伤与抑制神经细胞凋亡。林捷等研究发现葛根素预防性治疗脑梗死大鼠,能明显改善大鼠神经功能,脑梗死面积缩小,脑水肿程度降低,且呈剂量依赖性。另外,有关中药合剂抗CIRI作用的研究也见诸报道,如参芎注射液可保护血管内皮细胞,改善微循环,有利于神经元修复等。但目前尚未见中药复方抗CIRI作用的研究。本研究基于上述诸多中药治疗CIRI的研究,设计以银杏叶为主药的中药复方,观察该复方对下丘脑NGFR表达的影响。研究发现,GBE组大鼠的下丘脑视上核/室旁核的NGFR表达较Sham组明显升高,提示银杏叶复方能明显促进下丘脑NGFR的表达,因该实验设计在动物成模1月前开始用药,推测该复方可用来预处理CIRI大鼠来达到保护神经损伤的效果。同时亦发现,GBE组大鼠的下丘脑视上核/室旁核的NGFR表达较I/R组大鼠明显增加(P<0.01),表明银杏叶复方能明显促进CIRI大鼠下丘脑NGFR的表达,从而通过与NGF结合,促进神经细胞的生长发育,诱导轴突生长,下调促凋亡基因,而达到神经元保护作用。本研究表明银杏叶复方能促进CIRI大鼠下丘脑NG-FR的表达而产生神经保护作用。但CIRI的病理生理是一个多环节、多因素、多途径损伤的酶促级联反应,本实验仅是该中药复方研究的第一步,仅揭露了该复