心力衰竭大鼠下丘脑室旁核nadph亚基gp91phox表达与血流动力学的关系

心力衰竭大鼠下丘脑室旁核nadph亚基gp91phox表达与血流动力学的关系

心力衰竭（hf）是一种以身体神经系统功能障碍和异常血流动力学为主要特征的综合征。目前认为HF发生时交感神经系统首先被激活,交感末梢释放去甲肾上腺素对心肌细胞有直接毒性作用,并且引起肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)、内皮素、心房钠尿肽等体液机制的激活,进一步加重HF。因此对HF时交感神经兴奋机制的研究成为近来心血管疾病研究的热点。神经解剖学证实下丘脑室旁核神经元对外周交感神经活动有重要调节作用,其中体液因素,如:肾素血管紧张素系统、炎性细胞因子在HF时下丘脑室旁核增高,并与外周交感兴奋有关。近来研究发现HF时下丘脑室旁核氧化应激反应水平明显增高,Kang等认为氧化应激水平可能与交感神经兴奋性之间的关系更加密切。因此本研究采用侧脑室给药的方法探讨下丘脑室旁核氧化应激反应对HF时交感神经活动的影响。1材料和方法1.1麻醉大鼠模型建立成年健康雄性Sprage-Dawley鼠48只,体重(250±30)g,购于山西医科大学实验动物中心。随机分为HF手术组(HF组)、假手术组(SHAM组)各为24只。饲养于室温(23±2)℃和光照控制12h,不限制饮食和饮水。用戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉,气管插管,连接动物呼吸机(成都泰盟,HX-300),四肢皮下连接心电图电极进行心电监测(成都泰盟BL-420生物信号记录系统)。采用结扎左冠状动脉前降支方法诱导心力衰竭模型。假手术组只穿线不结扎。以术中II导联心电图出现ST段和/或T波抬高或降低,心脏局部颜色变暗等心肌缺血变化作为结扎成功的标志。关胸时给予青霉素(30000U),待大鼠苏醒后入笼饲养。次日再次麻醉大鼠,固定于脑立体定位仪上,剪开前囟周围皮肤,暴露前囟以及周围头骨,以前囟为中心,向中线右侧0.13cm,向尾侧0.08cm定位,用钻头钻开头骨,换0.7cm长7号针头插入0.4cm深即进入侧脑室,外接微型渗透压泵,泵内事先已灌入0.168mL氧自由基清除剂4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶(TEMPOL),泵埋入皮下后缝合皮肤。大鼠苏醒后饲养4周。1.2麻醉前准备工作成年健康雄性SD鼠,称重后戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉,取右心室、肺脏。用右心室/BW、肺脏/BW来反映HF的严重程度。1.3成都市泰盟生物能效实验系统单次给药4h被测大鼠术后4周时戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉,剪开颈部皮肤,分离颈部肌肉,暴露右侧颈总动脉,插入直径约0.5mm的硬塑管至主动脉,硬塑管另一端接成都泰盟生物机能实验系统(BL-420S)记录平均动脉压(MAP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左室压力最大上升、下降速率(±dp/dtmax)。然后腹侧面切开暴露肾脏,剥离肾神经,挂于银丝电极,通过生物机能实验系统记录肾交感神经放电(RSNA)4h。在一段相对控制的时间内,RSNA基础神经放电活动占最大神经放电活动百分比表示交感神经的兴奋性,最大交感神经放电峰值通过注射硝普钠来引发。1.4组织切片观察①采用经心脏灌流法固定脑标本。大鼠行戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉后移入灌流室,剪开胸腔,暴露心脏,从心尖部进针,沿心腔入升主动脉,400mL生理盐水冲洗后,改用4%多聚甲醛溶液500mL缓慢灌流。灌流完成后迅速取脑并放入4%多聚甲醛溶液4h,取出,再放入30%蔗糖溶液,1d至2d后组织沉底,即可切片。②免疫组织化学方法(SABC三步法):检测脑组织PVN区氧化应激反应水平。从蔗糖溶液中取出脑组织,OCT包埋,使用冰冻切片机切片(14μm),切片后室温晾干。pH7.2～7.4磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次,每次3min;Triton37℃孵育1h,PBS冲洗3次,每次3min;滴加封闭液,封闭20min。滴加小鼠抗大鼠gp91单克隆抗体(1∶100,美国santacruz公司),放置4℃冰箱内过夜。PBS冲洗3次,每次3min,加入山羊抗小鼠Ⅱ抗(武汉博士德公司)孵育30min;PBS冲洗3次,每次3min后,再加入辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素37℃孵育30min,PBS冲洗4次,每次5min后,每张切片滴加2滴新配制的DAB显色剂,室温下光镜观察其显色3min～5min,显色满意后自来水冲洗5min终止显色;之后常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片,利用图像分析系统进行分析。各组动物同时切片,并同时进行免疫组化染色。以确保免疫组化条件的同质性。1.5统计学处理axs的表示所有数据均以均数±标准差(ˉx±s)(x¯±s)表示,采用SPSS11.5统计学软件对数据进行t检验,P<0.05为有统计学意义。2结果2.1肺水肿发生情况假手术组及HF组大鼠的指标均来自于实验后4周获取的组织标本。HF组大鼠的右室/体重指数高于SHAM组(P<0.05),说明有右心室肥大;肺脏/体重指数高于SHAM组(P<0.05),说明有肺水肿发生。术后4周检测大鼠血流动力学,HF组大鼠左室舒张末压较假手术组明显增高(P<0.05),左室压力最大上升、下降速率(±dp/dtmax)绝对值均低于SHAM组(P<0.05),左心室收缩压较SHAM组明显降低(P<0.05),平均动脉压无统计学意义(P>0.05)。详见表1、表2。2.2各组大鼠肾电压结果见图1与SHAM组以及HF+TEMPOL组比较,HF组肾交感神经放电明显增多,SHAM组与HF组有差异,其他各组间无差异。2.3gp9phon表达免疫组化结果显示,心衰大鼠和对照组大鼠比较,下丘脑室旁核gp91phox表达显著增加。提示充血性心衰时,下丘脑室旁核氧化应激水平增高,tempol降低了心衰大鼠下丘脑室旁核gp91phox的表达。与SHAM组相比,HF组gp91phox阳性细胞数增高(P<0.05),与HF组相比,HF+TEMPOL组gp91phox阳性细胞数降低(P<0.05)。详见图2。3ros的来源心力衰竭时外周氧化应激反应增强,氧化应激是许多连锁反应的触发因素,在生理和病理中有重要的作用,其重要标志是形成许多致炎因子,产生活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)触发炎症反应,过多ROS超出了细胞内的抗氧化机制,就会对机体造成氧化损伤,这个生物过程称为氧化应激。细胞内的活性氧的来源复杂,除线粒体呼吸链代谢产生外,NADH/NADPH氧化酶是ROS的主要来源。NADPH氧化酶的结构包括结合于膜上的细胞色素b558(包括gp91phox和p22phox)和存在于胞浆内的水溶性蛋白(含p47phox、p67phox、和Racl/Rac2等亚单位),其中gp91phox是电子转移与氧离子生成的重要功能亚基。4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶(tempol)是一种具有分子量小、能够穿透生物膜的哌啶类一氧化二氮,能够清除体内的活性氧簇。本研究结果发现HF大鼠侧脑室给予tempol后PVN区域gp91phox降低,说明NADPH氧化酶依赖性氧化应激反应降低,同时观察到心功能有所改善,HF时左心室舒张末压升高、左室压力最大上升、下降速率降低,右心室/体重指数、肺脏/体重指数降低,